diff --git a/split/bib/zotero.bib b/split/bib/zotero.bib
index 1e8fd93..ea2d17c 100644
--- a/split/bib/zotero.bib
+++ b/split/bib/zotero.bib
@@ -3120,4 +3120,88 @@ @article{meredith_interactions_1983
date = {1983-07-22},
langid = {english},
file = {Version soumise:/home/ljp/Zotero/storage/ZNINNIHB/Meredith et Stein - 1983 - Interactions among converging sensory inputs in th.pdf:application/pdf}
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+
+@article{straka_connecting_2014,
+ title = {Connecting Ears to Eye Muscles: Evolution of a ‘Simple' Reflex Arc},
+ volume = {83},
+ issn = {0006-8977, 1421-9743},
+ url = {https://www.karger.com/Article/FullText/357833},
+ doi = {10.1159/000357833},
+ shorttitle = {Connecting Ears to Eye Muscles},
+ pages = {162--175},
+ number = {2},
+ journaltitle = {Brain, Behavior and Evolution},
+ shortjournal = {Brain Behav Evol},
+ author = {Straka, Hans and Fritzsch, Bernd and Glover, Joel C.},
+ urldate = {2020-12-04},
+ date = {2014},
+ langid = {english},
+ file = {Texte intégral:/home/ljp/Zotero/storage/ST2XVEUN/Straka et al. - 2014 - Connecting Ears to Eye Muscles Evolution of a ‘Si.pdf:application/pdf}
+}
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+@article{bagnall_modular_2014,
+ title = {Modular Organization of Axial Microcircuits in Zebrafish},
+ volume = {343},
+ issn = {0036-8075, 1095-9203},
+ url = {https://www.sciencemag.org/lookup/doi/10.1126/science.1245629},
+ doi = {10.1126/science.1245629},
+ pages = {197--200},
+ number = {6167},
+ journaltitle = {Science},
+ shortjournal = {Science},
+ author = {Bagnall, M. W. and {McLean}, D. L.},
+ urldate = {2020-12-04},
+ date = {2014-01-10},
+ langid = {english},
+ file = {Version acceptée:/home/ljp/Zotero/storage/N2LVJKT9/Bagnall et McLean - 2014 - Modular Organization of Axial Microcircuits in Zeb.pdf:application/pdf}
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+
+@article{thiele_descending_2014,
+ title = {Descending Control of Swim Posture by a Midbrain Nucleus in Zebrafish},
+ volume = {83},
+ issn = {08966273},
+ url = {https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0896627314003328},
+ doi = {10.1016/j.neuron.2014.04.018},
+ pages = {679--691},
+ number = {3},
+ journaltitle = {Neuron},
+ shortjournal = {Neuron},
+ author = {Thiele, Tod R. and Donovan, Joseph C. and Baier, Herwig},
+ urldate = {2020-12-04},
+ date = {2014-08},
+ langid = {english},
+ file = {Texte intégral:/home/ljp/Zotero/storage/AG2GVG2P/Thiele et al. - 2014 - Descending Control of Swim Posture by a Midbrain N.pdf:application/pdf}
+}
+
+@article{graf_excitatory_1997,
+ title = {Excitatory and Inhibitory Vestibular Pathways to the Extraocular Motor Nuclei in Goldfish},
+ volume = {77},
+ issn = {0022-3077, 1522-1598},
+ url = {https://www.physiology.org/doi/10.1152/jn.1997.77.5.2765},
+ doi = {10.1152/jn.1997.77.5.2765},
+ abstract = {Graf, Werner, Robert Spencer, Harriet Baker, and Robert Baker. Excitatory and inhibitory vestibular pathways to the extraocular motor nuclei in goldfish. J. Neurophysiol. 77: 2765–2779, 1997. Electrophysiological, ultrastructural, and immunohistochemical techniques were utilized to describe the excitatory and inhibitory vestibular innervation of extraocular motor nuclei in the goldfish. In antidromically activated oculomotor motoneurons, electrical stimulation of the intact contralateral vestibular nerve produced short-latency, variable amplitude electrotonic excitatory postsynaptic potentials ({EPSPs}) at 0.5–0.7 ms followed by chemical {EPSPs} at 1.0–1.3 ms. Stimulation of the ipsilateral vestibular nerve produced small amplitude membrane hyperpolarizations at a latency of 1.3–1.7 ms in which equilibrium potentials were slightly more negative than resting potentials. The inhibitory postsynaptic potentials ({IPSPs}) reversed with large amplitudes after the injection of chloride ions suggesting a proximal soma-dendritic location of terminals exhibiting high efficacy inhibitory synaptic conductances. In antidromically identified abducens motoneurons and putative internuclear neurons, electrical stimulation of the contralateral vestibular nerve produced large-amplitude, short-latency electrotonic {EPSPs} at 0.5 ms followed by chemical depolarizations at 1.2–1.3 ms. Stimulation of the ipsilateral vestibular nerve evoked {IPSPs} at 1.4 ms that were reversed after injection of current and/or chloride ions. γ-Aminobutyric acid ({GABA}) antibodies labeled inhibitory neurons in vestibular subdivisions with axons projecting into the ipsilateral medial longitudinal fasciculus ({MLF}). Putative {GABAergic} terminals surrounded oculomotor, but not abducens, motoneurons retrogradely labeled with horseradish peroxidase. Hence the spatial distribution of {GABAergic} neurons and terminals appears highly similar in the vestibuloocular system of goldfish and mammals. Electron microscopy of motoneurons in the oculomotor and abducens nucleus showed axosomatic and axodendritic synaptic endings containing spheroidal synaptic vesicles establishing chemical, presumed excitatory, synaptic contacts with asymmetric pre- and/or postsynaptic membrane specializations. The majority of contacts with spheroidal vesicles displayed gap junctions in which the chemical and electrotonic synapses were either en face to dissimilar or adjacent to one another on the same soma/dendritic profiles. Another separate set of axosomatic synaptic endings, presumed to be inhibitory, contained pleiomorphic synaptic vesicles with symmetric pre- and/or postsynaptic membrane specializations that never included gap junctions. Excitatory and inhibitory synaptic contacts appeared equal in number but were more sparsely distributed along the soma-dendritic profiles of oculomotor as compared with abducens motoneurons. Collectively these data provide evidence for both disynaptic vestibular inhibition and excitation in all subdivisions of the extraocular motor nuclei suggesting the basic vestibulooculomotor blueprint to be conserved among vertebrates. We propose that unique vestibular neurons, transmitters, pathways, and synaptic arborizations are homologous structural traits that have been essentially preserved throughout vertebrate phylogeny by a shared developmental plan.},
+ pages = {2765--2779},
+ number = {5},
+ journaltitle = {Journal of Neurophysiology},
+ shortjournal = {Journal of Neurophysiology},
+ author = {Graf, Werner and Spencer, Robert and Baker, Harriet and Baker, Robert},
+ urldate = {2020-12-04},
+ date = {1997-05-01},
+ langid = {english},
+ file = {Version soumise:/home/ljp/Zotero/storage/KC9GFZCC/Graf et al. - 1997 - Excitatory and Inhibitory Vestibular Pathways to t.pdf:application/pdf}
+}
+
+@article{straka_vestibular_2013,
+ title = {Vestibular blueprint in early vertebrates},
+ volume = {7},
+ issn = {1662-5110},
+ url = {http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fncir.2013.00182/abstract},
+ doi = {10.3389/fncir.2013.00182},
+ journaltitle = {Frontiers in Neural Circuits},
+ shortjournal = {Front. Neural Circuits.},
+ author = {Straka, Hans and Baker, Robert},
+ urldate = {2020-12-04},
+ date = {2013},
+ file = {Texte intégral:/home/ljp/Zotero/storage/N9R3GBIA/Straka et Baker - 2013 - Vestibular blueprint in early vertebrates.pdf:application/pdf}
}
\ No newline at end of file
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index 6527dc7..41df787 100644
--- a/split/chap0.tex
+++ b/split/chap0.tex
@@ -114,10 +114,10 @@ \subsection{Imagerie fonctionnelle calcique}
\subsubsection{Architecture et fonctionnement du neurone}
-\begin{figure}
+\begin{figure}[b]
\centering
\includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/neurone.svg.png}
- \caption{Schéma d'un neurone accompagné de cellules gliales. Astrocytes (en vert), oligodendrocytes (en bleu). Le neurone dispose d'un long prolongement appelé axone qui le connecte à d'autres neurones via des boutons synaptiques.}
+ \caption{Neurone accompagné de cellules gliales. Astrocytes (en vert), oligodendrocytes (en bleu). Le neurone dispose d'un long prolongement appelé axone qui le connecte à d'autres neurones via des boutons synaptiques.}
\end{figure}
Le neurone est une cellule caractérisée par son prolongement axonal capable de transmettre un influx nerveux. Il est toujours accompagné par des cellules gliales comme les astrocytes ou les oligodendrocytes qui assurent en grande partie les fonctions métaboliques. Le neurone est aujourd'hui considéré comme le principal responsable des processus cognitifs bien que de nombreuses recherches montrent l'importance des cellules gliales dans des phénomènes tels que l'intégration du signal calcique et l'établissement de connexions synaptiques \cite{verkhratsky_calcium_1996} \cite{pfrieger_synaptic_1997}.
@@ -158,7 +158,7 @@ \subsubsection{Fluorescence}
\begin{figure}
\centering
-\includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/fluo_couleur.svg.png}
+\includegraphics[width=0.95\textwidth]{./files/fluo_couleur.svg.png}
\caption{Illustration du phénomène de fluorescence. À gauche, le point de vue quantique avec les niveaux d'énergie interne, à droite, les spectres d’absorption et d'émission qui en résultent.}
\end{figure}
@@ -255,25 +255,26 @@ \subsubsection{Système visuel}
\subsubsection{Système vestibulaire}
\paragraph{Organisation}
-L'organe vestibulaire, quant à lui, est situé dans l'oreille interne. Grâce à des cellules ciliées sensibles à leur propre déflexion, il peut mesurer les accélérations inertielle et gravitationnelle auxquelles sont soumises les otolithes (petites pierres osseuses) et les accélérations angulaires du liquide présent dans les canaux semi-circulaires. Bien que quasiment matures chez la larve dès cinq jours, la taille des canaux semi-circulaires les rend inefficaces. Seuls les otolithes sont fonctionnels et seul l'utricule (un des otolithes, Fig. \ref{FIGorganevestib}) sert à la détection vestibulaire. Cela est cependant suffisant (et nécessaire \cite{riley_development_2000}) pour que la larve puisse nager tout en conservant son équilibre.
\begin{figure}
\centering
- \includegraphics[width=0.7\textwidth]{./files/appareil_vestibulaire.svg.png}
+ \includegraphics[width=0.75\textwidth]{./files/appareil_vestibulaire.svg.png}
\caption{Photographies et schéma des organes vestibulaires. Adapté de G. Migault
- \\ A. Larve de poisson zèbre de 6 jours vue de dessus (haut) et de côté (bas). On distingue les yeux (Y), l'oreille interne avec ses otolithes (O) et la vessie natatoire (VNat).
- \\ B. Agrandissement de l'oreille interne vue de côté (B1) avec le schéma correspondant (B2). On souligne en pointillé les canaux semi-circulaires, en gris les deux otolithes, et en couleur les neuro-épithéliums.
- \\ C. Otolithe en fonctionnement. Lorsqu'il est à l'horizontale (C1), les cils sont au repos, lorsqu'il est incliné (C2), les cils sont défléchis car l'accélération gravitationnelle change de direction, lorsqu'il est en mouvement accéléré vers la gauche (C3), l'accélération inertielle (a) s'ajoute à l'accélération gravitationnelle (g) et donne la résultante (r). On voit que l'utricule ne permet pas de différencier l'accélération gravitationnelle de l'accélération inertielle.
+ \\ a. Larve de poisson zèbre de 6 jours vue de dessus (haut) et de côté (bas). On distingue les yeux (Y), l'oreille interne avec ses otolithes (O) et la vessie natatoire (VNat).
+ \\ b. Agrandissement de l'oreille interne vue de côté (b1.) avec le schéma correspondant (b2.). On souligne en pointillé les canaux semi-circulaires, en gris les deux otolithes, et en couleur les neuro-épithéliums.
+ \\ c. Otolithe en fonctionnement. Lorsqu'il est à l'horizontale (c1.), les cils sont au repos, lorsqu'il est incliné (c2.), les cils sont défléchis car l'accélération gravitationnelle change de direction, lorsqu'il est en mouvement accéléré vers la gauche (c3.), l'accélération inertielle (a) s'ajoute à l'accélération gravitationnelle (g) et donne la résultante (r). On voit que l'utricule ne permet pas de différencier l'accélération gravitationnelle de l'accélération inertielle.
\label{FIGorganevestib}}
\end{figure}
+L'organe vestibulaire, quant à lui, est situé dans l'oreille interne. Grâce à des cellules ciliées sensibles à leur propre déflexion, il peut mesurer les accélérations inertielle et gravitationnelle auxquelles sont soumises les otolithes (petites pierres osseuses) et les accélérations angulaires du liquide présent dans les canaux semi-circulaires. Bien que quasiment matures chez la larve dès cinq jours, la taille des canaux semi-circulaires les rend inefficaces. Seuls les otolithes sont fonctionnels et seul l'utricule (un des otolithes, Fig. \ref{FIGorganevestib}) sert à la détection vestibulaire. Cela est cependant suffisant (et nécessaire \cite{riley_development_2000}) pour que la larve puisse nager tout en conservant son équilibre.
+
Les neurones répondant aux stimulations vestibulaires sont présents à de nombreux endroits du cerveau, à la fois dans le prosencéphale (télencéphale, habenulae, thalamus, prétectum), dans le mésencéphale (tectum, nMLF, tegentum), et dans le rombencéphale (cervelet, MON, rhombomère 5-7) \cite{favre-bulle_cellular-resolution_2018}. Chacune de ces régions est impliquée différemment dans les réflexes vestibulaires comme le réflexe vestibulo-oculaire (\emph{vestibulo-ocular reflex}, VOR) et le contrôle postural ou réflexe vestibulo-spinal (\emph{vestibulo-spinal reflex}, VSR).
\paragraph{VOR, réflexe vestibulo-oculaire} \label{VOR}
Le VOR, largement répandu chez les vertébrés, est également observé chez le poisson-zèbre \cite{bianco_tangential_2012}. C'est un mouvement réflexe des yeux qui compense les mouvements de la tête pour stabiliser la vision. Bianco \emph{et al} l'ont mis en évidence chez la larve de poisson zèbre de plus de 4 jours en la soumettant à une rotation selon l'axe de tangage, ce qui génère une rotation des yeux opposée, avec un angle limité par le maximum physiologique. Le circuit neuronal associé est constitué d'un neurone afférent primaire, un neurone vestibulaire de second ordre, et un motoneurone oculaire qui guide la rotation de l’œil. Ce circuit est présent en deux exemplaires avec une symétrie bilatérale, un pour chaque utricule (gauche et droit). Il a également été montré que les neurones du noyau tangentiel ont des projections dans les motoneurones oculaires contra-latéraux, et que ces neurones sont essentiels au fonctionnement du réflexe.
\paragraph{VSR, réflexe vestibulo-spinal} \label{VSR}
-Le VSR est un réflexe de contrôle de posture qui utilise également l'information vestibulaire. Chez le poisson zèbre adulte, la vessie natatoire est un organe important qui permet de contrôler la flottaison, mais chez la larve, elle n'est pas encore fonctionnelle. Les effecteurs du contrôle postural sont donc surtout la queue et les nageoires. Ehrlich \emph{et al} ont étudié le déséquilibre naturel de la larve en \emph{tangage} et ont montré que les événements de nage sont à la base du développement de l'équilibre \cite{ehrlich_control_2017}. Favre-Bulle \emph{et al} ont étudié le contrôle de l'équilibre dans l'axe de \emph{roulis} en stimulant directement les utricules dans l'oreille interne et ont constaté une déflexion proportionnelle de la queue \cite{favre-bulle_cellular-resolution_2018}.
+Le VSR est un réflexe de contrôle de posture qui utilise également l'information vestibulaire. Chez le poisson zèbre adulte, la vessie natatoire est un organe important qui permet de contrôler la flottaison, mais chez la larve, elle n'est pas encore fonctionnelle. Les effecteurs du contrôle postural sont donc surtout la queue et les nageoires. Ehrlich \emph{et al} ont étudié le déséquilibre naturel de la larve en \emph{tangage} et ont montré que les événements de nage sont à la base du développement de l'équilibre \cite{ehrlich_control_2017}. Favre-Bulle \emph{et al} ont étudié le contrôle de l'équilibre dans l'axe de \emph{roulis} en stimulant directement les utricules dans l'oreille interne et ont constaté une déflexion proportionnelle de la queue \cite{favre-bulle_cellular-resolution_2018}. Thiele \emph{et al} ont étudié en détail les bases neuronales du contrôle postural en roulis \cite{thiele_descending_2014}.
\subsubsection{Intégration visuo-vestibulaire}
diff --git a/split/chap1.tex b/split/chap1.tex
index 6f0ea5a..d403034 100644
--- a/split/chap1.tex
+++ b/split/chap1.tex
@@ -1,34 +1,36 @@
\chapter[Contrôle postural en VR]{Contrôle postural dans un environnement virtuel}\label{chapII}
-La larve de poisson zèbre est intrinsèquement déséquilibrée. Son centre de gravité est décalé vers l'avant par rapport à son centre de flottaison, ce qui la fait piquer du nez dans l'axe de tangage. Une larve paralysée se retrouve sur le flanc dans l'axe de roulis. C'est donc par un contrôle permanent qu'elle se maintient à l'horizontale (roulis et tangage). Pour cela, elle utilise à la fois les informations visuelle et vestibulaire pour déclencher des mouvements de queue et de nageoires qui la stabilisent. Ces comportements complexes ont été étudiés en nage libre par David Ehrlich et David Schoppik \cite{ehrlich_control_2017}\cite{ehrlich_balance_2018}\cite{ehrlich_primal_2019}, mais pour comprendre les mécanismes neuronaux à l'œuvre, il est nécessaire de fixer le poisson sous un objectif de microscope. J'ai donc cherché à reproduire ces comportements dans un environnement virtuel en vue d'une étude sous microscope.
+La larve de poisson zèbre est intrinsèquement déséquilibrée \cite{bagnall_development_2018}. Son centre de gravité est décalé vers l'avant par rapport à son centre de flottaison, ce qui la fait piquer du nez dans l'axe de tangage. Une larve paralysée se retrouve sur le flanc dans l'axe de roulis. C'est donc par un contrôle permanent qu'elle se maintient à l'horizontale (roulis et tangage). Pour cela, elle utilise à la fois les informations visuelle et vestibulaire pour déclencher des mouvements de queue et de nageoires qui la stabilisent. Ces comportements complexes ont été étudiés en nage libre par David Ehrlich et David Schoppik \cite{ehrlich_control_2017}\cite{ehrlich_balance_2018}\cite{ehrlich_primal_2019}, mais pour comprendre les mécanismes neuronaux à l'œuvre, il est nécessaire de fixer le poisson sous un objectif de microscope. J'ai donc cherché à reproduire ces comportements dans un environnement virtuel en vue d'une étude sous microscope.
\section{Description de la boucle sensorimotrice}
-La larve de poisson zèbre évolue dans un environnement en trois dimensions. Elle peut se déplacer suivant les trois degrés de liberté en translation et s'orienter suivant les trois degrés de liberté en rotation. Certains comportements comme la thigmotaxie (affection pour les bords) sont liés à sa position dans son environnement, mais dans le cadre du contrôle postural, on s'intéresse surtout à deux degrés de rotation que sont le roulis et le tangage.
+\begin{figure}[b]
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/fish.png}
+ \caption{Larve de poisson zèbre dans sa position naturelle. Cette position est hors équilibre, un poisson inactif tourne sur l'axe de roulis et de tangage.
+ \label{FIGroulistangage}}
+ \end{figure}
-\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/fish.png}
-\caption{Larve de poisson zèbre dans sa position naturelle. Cette position est hors équilibre, un poisson inactif tourne sur l'axe de roulis et de tangage.}
-\end{figure}
+La larve de poisson zèbre évolue dans un environnement en trois dimensions. Elle peut se déplacer suivant les trois degrés de liberté en translation et s'orienter suivant les trois degrés de liberté en rotation (Fig. \ref{FIGroulistangage}). Certains comportements comme la thigmotaxie (affection pour les bords) sont liés à sa position dans son environnement, mais dans le cadre du contrôle postural, on s'intéresse surtout à deux degrés de rotation que sont le roulis et le tangage.
\subsection{Roulis}
Dans l'axe de roulis, la larve contrôle son équilibre par des déflexions latérales de la queue. Si elle penche trop à gauche, elle bascule sa queue vers la droite, comme un humain utilisant ses bras pour s'équilibrer. Le contrôle postural en roulis se fait donc par une boucle de rétroaction sensorimotrice continue. L'angle de référence est de 0°, l'organe vestibulaire mesure l'écart à cet angle, et la queue le compense par une déflexion opposée. Ce comportement a été observé par Favre-Bulle \emph{et al} \cite{favre-bulle_optical_2017} en simulant une rotation via une manipulation de l'utricule dans l'oreille interne par des pinces optiques. Cette étude a été réalisée en boucle ouverte, c'est-à-dire sans rétroaction, ce qui fait que la larve ne pouvait pas constater les effets de son mouvement. Une expérience de réalité virtuelle en rétroaction pourrait simuler un déséquilibre proportionnel à l'angle de la queue, ce qui permettrait à la larve d'en corriger l'angle en temps réel.
\subsection{Tangage}
-Dans l'axe de tangage, la situation est plus compliquée. L'angle que fait la larve avec l'horizontale dépend de sa direction de déplacement. Par exemple, une larve se place à un angle positif lorsqu'elle nage vers le haut pour remonter à la surface et un angle négatif quand elle nage vers le bas \cite{ehrlich_primal_2019}. Cet angle constitue une référence autour de laquelle la larve cherche à se stabiliser. Ehrlich et Schoppik ont montré que le contrôle de l'angle se faisait pendant les mouvements de nage \cite{ehrlich_control_2017}. La larve de poisson zèbre nage de manière discrète via des mouvements réguliers à une fréquence d'environ un par seconde en nage libre. Entre deux mouvements, qui peuvent être détectés par des pics de vitesse, elle est soumise à son déséquilibre et bascule vers l'avant à une vitesse angulaire déterminée par sa morphologie. Lors d'un mouvement, en fonction de la force et la position des nageoires, l'angle augmente d'un coup. De plus, les auteurs suggèrent que l'initiation du mouvement est induite par l'angle ressenti. Ils ont augmenté artificiellement le déséquilibre de la larve, conduisant à une chute plus rapide et ont constaté que la larve compensait ce déséquilibre supplémentaire par une augmentation de la fréquence des mouvements de nage (Fig. \ref{FIGmovementinitiation}).
-Le contrôle postural en tangage est donc le résultat d'une boucle de rétroaction sensorimotrice discrète. L'angle cible varie entre -15° et +20° environ et dépend de la direction souhaitée par le poisson et d'un certain angle d'attaque \cite{ehrlich_primal_2019}. L'action de contrôle de l'angle implique à la fois la queue et les nageoires et se fait au moment des événements de nage, dont la fréquence peut être ajustée en fonction du déséquilibre.
\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=0.9\textwidth]{./files/schoppik_movement-initiation.svg.png}
-\caption{Boucle de rétroaction sensorimotrice et initiation du mouvement lors du contrôle postural en tangage. Adapté de Ehrlich et al \cite{ehrlich_control_2017}
-\\ a. Le centre de gravité et de flottaison de la larve sont décalés, ce qui cause un déséquilibre dans l'axe de tangage.
-\\ b. La larve nage de manière discrète (non continue), à une fréquence de $\sim$1 Hz. Entre deux événements, la larve inactive est entraînée par son déséquilibre, nez vers le bas à une vitesse de $\sim$6°/sec. Lors des événements de nage (pic de vitesse), l'angle est corrigé de $\sim$6°.
-\\ c. En remplaçant l'eau de la vessie natatoire par de l'huile, ce qui augmente le déséquilibre, les auteurs ont constaté une augmentation de la fréquence (diminution de l'IEI, intervalle inter-événement), ce qu'ils attribuent au contrôle de la posture via l'information vestibulaire.
-\\ d. La boucle sensorimotrice discrète responsable du contrôle postural est capable d'une adaptation en fréquence suite à une perturbation de l'équilibre du poisson.
-\label{FIGmovementinitiation}}
-\end{figure}
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.9\textwidth]{./files/schoppik_movement-initiation.svg.png}
+ \caption{Boucle de rétroaction sensorimotrice et initiation du mouvement lors du contrôle postural en tangage. Adapté de Ehrlich et al \cite{ehrlich_control_2017}
+ \\ a. Le centre de gravité et de flottaison de la larve sont décalés, ce qui cause un déséquilibre dans l'axe de tangage.
+ \\ b. La larve nage de manière discrète (non continue), à une fréquence de $\sim$1 Hz. Entre deux événements, la larve inactive est entraînée par son déséquilibre, nez vers le bas à une vitesse de $\sim$6°/sec. Lors des événements de nage (pic de vitesse), l'angle est corrigé de $\sim$6°.
+ \\ c. En remplaçant l'eau de la vessie natatoire par de l'huile, ce qui augmente le déséquilibre, les auteurs ont constaté une augmentation de la fréquence (diminution de l'IEI, intervalle inter-événement), ce qu'ils attribuent au contrôle de la posture via l'information vestibulaire.
+ \\ d. La boucle sensorimotrice discrète responsable du contrôle postural est capable d'une adaptation en fréquence suite à une perturbation de l'équilibre du poisson.
+ \label{FIGmovementinitiation}}
+ \end{figure}
+
+Dans l'axe de tangage, la situation est plus compliquée. L'angle que fait la larve avec l'horizontale dépend de sa direction de déplacement. Par exemple, une larve se place à un angle positif lorsqu'elle nage vers le haut pour remonter à la surface et un angle négatif quand elle nage vers le bas \cite{ehrlich_primal_2019}. Cet angle constitue une référence autour de laquelle la larve cherche à se stabiliser. Ehrlich et Schoppik ont montré que le contrôle de l'angle se faisait pendant les mouvements de nage \cite{ehrlich_control_2017}. La larve de poisson zèbre nage de manière discrète via des mouvements réguliers à une fréquence d'environ un par seconde en nage libre. Entre deux mouvements, qui peuvent être détectés par des pics de vitesse, elle est soumise à son déséquilibre et bascule vers l'avant à une vitesse angulaire déterminée par sa morphologie. Lors d'un mouvement, en fonction de la force et la position des nageoires, l'angle augmente d'un coup. De plus, les auteurs suggèrent que l'initiation du mouvement est induite par l'angle ressenti. Ils ont augmenté artificiellement le déséquilibre de la larve, conduisant à une chute plus rapide et ont constaté que la larve compensait ce déséquilibre supplémentaire par une augmentation de la fréquence des mouvements de nage (Fig. \ref{FIGmovementinitiation}).
+Le contrôle postural en tangage est donc le résultat d'une boucle de rétroaction sensorimotrice discrète. L'angle cible varie entre -15° et +20° environ et dépend de la direction souhaitée par le poisson et d'un certain angle d'attaque \cite{ehrlich_primal_2019}. L'action de contrôle de l'angle implique à la fois la queue et les nageoires et se fait au moment des événements de nage, dont la fréquence peut être ajustée en fonction du déséquilibre.
On voit ici deux boucles sensorimotrices différentes impliquée dans le contrôle postural. Ces boucles de rétroaction ont des caractéristiques différentes en termes de valeur cible et de mécanisme de contrôle. Je décris par la suite une plateforme expérimentale que j'ai mise au point afin d'étudier le contrôle postural en réalité virtuelle.
@@ -36,16 +38,17 @@ \section{Étude comportementale du contrôle postural}
\subsection{Plateforme expérimentale}
-Pour reproduire la boucle de rétroaction du contrôle postural, il faut soumettre le poisson à une stimulation vestibulaire, détecter ses mouvements de queue et rétroagir sur son orientation. Avec l'aide de Thomas Panier, j'ai développé une plateforme expérimentale pour répondre à cette problématique (Fig. \ref{FIGexpplatformbehavior}). Elle est constituée d'une cuve où l'on place la larve, d'un système d'imagerie pour suivre les mouvements de queue, d'un projecteur pour projeter un environnement visuel sur les parois de la cuve, d'un moteur pour entraîner la plateforme sur laquelle repose le tout, et d'un ordinateur pour réaliser la boucle de rétroaction. Je décris ci-dessous les différents éléments.
-
-\begin{figure}
+\begin{figure}[b!]
\centering
- \includegraphics[width=0.7\textwidth]{./files/schéma_manip.svg.png}
+ \includegraphics[width=0.75\textwidth]{./files/schéma_manip.svg.png}
\caption{Plateforme expérimentale permettant d'étudier le contrôle postural d'une larve de poisson zèbre pendant une boucle de rétroaction. Le système d'imagerie et la cuve sont fixés sur une plateforme rotative, mais pas le projecteur.
\label{FIGexpplatformbehavior}}
\end{figure}
+Pour reproduire la boucle de rétroaction du contrôle postural, il faut soumettre le poisson à une stimulation vestibulaire, détecter ses mouvements de queue et rétroagir sur son orientation. Avec l'aide de Thomas Panier, j'ai développé une plateforme expérimentale pour répondre à cette problématique (Fig. \ref{FIGexpplatformbehavior}). Elle est constituée d'une cuve où l'on place la larve, d'un système d'imagerie pour suivre les mouvements de queue, d'un projecteur pour projeter un environnement visuel sur les parois de la cuve, d'un moteur pour entraîner la plateforme sur laquelle repose le tout, et d'un ordinateur pour réaliser la boucle de rétroaction. Je décris ci-dessous les différents éléments.
+
\subsubsection{Stimulation vestibulaire}
+
Le but de la cuve rotative est de soumettre le poisson à une stimulation vestibulaire contrôlée, et de pouvoir agir rapidement sur la commande (position angulaire, vitesse angulaire). Le moteur que j'ai utilisé pour entraîner la plateforme est le modèle DMAC17 de l'entreprise \href{http://www.midi-ingenierie.com/}{midi-ingéniérie}. Le modèle était assez ancien et ne disposait que d'une interface rudimentaire, j'ai donc dû réimplémenter une commande série pour communiquer avec le microcontrôleur de la commande moteur. Finalement, la communication introduit une latence de quelques dizaines de millisecondes et impose un délai entre deux instructions d'une trentaine de millisecondes. Cela semble cependant suffisant pour garantir une bonne impression de réalité virtuelle, puisque chez l'humain, les effets liés à la latence commencent à se faire sentir à partir de 75 ms \cite{waltemate_impact_2016}. Un problème que j'ai rencontré au début était les mouvements de l'eau dans la cuve. Le poisson y est très sensible via sa ligne latérale postérieure, ce qui faussait les expériences. En perçant un trou en haut de la cuve, j'ai pu la remplir sans laisser d'air et refermer avec un bouchon étanche. Cela a permis de maintenir l'eau de la cuve pratiquement immobile et de contourner ce problème.
\subsubsection{Imagerie et analyse}
@@ -75,15 +78,17 @@ \subsubsection{Stimulation visuelle}
Pour avoir un contrôle très souple sur l'environnement visuel du poisson du point de vue des couleurs, de la luminosité, et des formes, la solution idéale est un projecteur. Afin d'obtenir un bon contraste, les parois de la cuve sont coniques et blanches, réalisées dans un cylindre de PVC. Un cache évite d'éclairer directement le poisson pour ne pas perturber son environnement visuel. Les motifs sont réalisés à l'aide de \href{http://psychtoolbox.org/}{psychtoolbox}, une bibliothèque conçue pour l'affichage de stimulations visuelles. Pour conserver une fréquence d'affichage indépendante de la boucle de rétroaction et ainsi garantir un taux constant d'images par seconde d'expérience en expérience, j'ai séparé le processus de la boucle principale, avec laquelle il communique par le protocole TCP/IP.
\subsubsection{Insertion de la larve}
-Pour immobiliser la larve de poisson zèbre, il est fréquent de la piéger dans un gel d'agarose à basse température de fusion concentré à 2\% aspiré par un capillaire en verre de diamètre intérieur 0.8 mm. Le capillaire est inséré dans un trou de 1.4 mm (son diamètre extérieur), ce qui le maintient fermement. La larve peut ainsi être placée dans l'une des deux positions suivantes. L'une, sur l'axe de rotation, permet d'étudier la réponse comportementale à une stimulation en roulis, l'autre, perpendiculaire, permet d'étudier la réponse à une stimulation en tangage (Fig. \ref{FIGexpplatformbehavior}). Afin d'observer les mouvements de la queue, je la libère en retirant la partie du boudin d'agarose qui l'entoure (Fig. \ref{FIGagar}).
-\begin{figure}
+\begin{figure}[b]
\centering
- \includegraphics[width=0.5\textwidth]{./files/prepa_larve.png}
+ \includegraphics[width=0.5\textwidth]{./files/prepa_larve.jpg}
\caption{À l'aide d'un scalpel, un boudin d'agar est retiré de la queue d'une larve pour lui permettre de bouger. La larve est retenue par la tête et le corps, l'autre partie du boudin étant tenue par le capillaire en verre.
\label{FIGagar}}
\end{figure}
+Pour immobiliser la larve de poisson zèbre, il est fréquent de la piéger dans un gel d'agarose à basse température de fusion concentré à 2\% aspiré par un capillaire en verre de diamètre intérieur 0.8 mm. Le capillaire est inséré dans un trou de 1.4 mm (son diamètre extérieur), ce qui le maintient fermement. La larve peut ainsi être placée dans l'une des deux positions suivantes. L'une, sur l'axe de rotation, permet d'étudier la réponse comportementale à une stimulation en roulis, l'autre, perpendiculaire, permet d'étudier la réponse à une stimulation en tangage (Fig. \ref{FIGexpplatformbehavior}). Afin d'observer les mouvements de la queue, je la libère en retirant la partie du boudin d'agarose qui l'entoure (Fig. \ref{FIGagar}).
+
+
\subsection{Protocoles et résultats}
\subsubsection{Test par l'OMR}
@@ -136,15 +141,14 @@ \subsubsection{Protocole multimodal}
\centering
\includegraphics[width=0.95\textwidth]{./files/protocole_multimodal.svg.png}
\caption{
- Protocole multimodal faisant intervenir à la fois une stimulation vestibulaire et une stimulation visuelle. Des cycles d'une minute sont séparés par des pauses de vingt secondes.
- Le protocole appliqué sur trois poissons différents (a, b, c.) pour lesquels on présente la réponse sous la même forme qu'en figure \ref{FIGvariationvitesse} : en haut la vitesse de la queue au cours du temps et en bas l'angle de la plateforme. Dans tous les cas, la réponse optomotrice fonctionne, mais on voit des différences au niveau des autres stimuli. Le poisson (a.) répond bien à la stimulation visuelle, mais quasiment pas à la stimulation vestibulaire, le poisson (b.), au contraire, ne répond pas à la stimulation visuelle (bien qu'il réponde à l'OMR), mais répond à la stimulation vestibulaire pure. Le poisson (c.) ne répond ni à la stimulation visuelle pure, ni à la stimulation visuelle pure, mais répond comme les deux autres pendant le cycle multimodal.
- \\ Ces comportements semblent spécifiques à un poisson. Par exemple, le protocole a été répété cinq fois sur le poisson (c.) avec chaque fois une réponse similaire : réponse à l'OMR, et réponse multisensorielle, mais peu de réponse pour un stimulus seul.
+ Protocole multimodal faisant intervenir à la fois une stimulation vestibulaire et une stimulation visuelle. Les différentes étapes du protocole sont schématisées par une vue de côté de la larve dans la cuve exposée à différents stimuli (visuel en rouge, vestibulaire en bleu). Les barres colorées en dessous représentent la chronologie des étapes du protocole : des cycles d'une minute (OMR, visuel, multimodal, vestibulaire) sont séparés par des pauses de vingt secondes.
+ On présente la réponse de trois poissons différents (a, b, c.) sous la même forme qu'en figure \ref{FIGvariationvitesse} (en haut la vitesse de la queue et en bas l'angle de la plateforme). Dans tous les cas, la réponse optomotrice fonctionne, mais on voit des différences au niveau des autres stimuli. Le poisson (a.) répond bien à la stimulation visuelle, mais quasiment pas à la stimulation vestibulaire, le poisson (b.), au contraire, ne répond pas à la stimulation visuelle (bien qu'il réponde à l'OMR), mais répond à la stimulation vestibulaire pure. Le poisson (c.) ne répond ni à la stimulation visuelle pure, ni à la stimulation visuelle pure, mais répond comme les deux autres pendant le cycle multimodal.
\label{FIGprotocolmulti}}
\end{figure}
L'intérêt de l'environnement virtuel est qu'il est possible de contrôler à la fois la stimulation vestibulaire et la stimulation visuelle. Après avoir étudié le contrôle postural dans le noir, j'y ai ajouté une composante visuelle. L'objectif est de comparer la réponse en cas de stimulation multimodale par rapport aux réponses en présence des deux stimuli séparément.
-Le protocole (illustré en Fig. \ref{FIGprotocolmulti}) comporte les étapes suivantes.
+Le protocole (illustré en Fig. \ref{FIGprotocolmulti}) comporte les étapes suivantes.
\begin{enumerate}
\item Il commence par un cycle d'OMR avec rétroaction, qui permet d'évaluer le niveau d'activité du poisson. S'il ne répond pas à cette stimulation, l'expérience est interrompue pour passer au poisson suivant, ce qui permet de gagner un quart d'heure en évitant de collecter des données sur une larve immobile.
@@ -159,8 +163,6 @@ \subsubsection{Protocole multimodal}
Sur un total de 113 larves préparées, 24 se sont échappées ou sont mortes avant l'expérience (reste 89), j'ai appliqué le protocole décrit ci-dessus et 53 larves ne présentaient aucune réponse optomotrice, ou seulement des tentatives d'échappement (reste 36). Sur ces 36 larves restantes, qui présentaient donc toutes une réponse optomotrice, 24 ont montré une réponse quasi nulle lors des autres étapes du protocole et ont donc été retirée du compte (reste 12). Les 12 larves restantes ont eu des réponse différentes au protocole. Certaines (3) répondaient principalement au stimulus visuel seul ou bimodal (Fig. \ref{FIGprotocolmulti} a.), certaines (5) répondaient principalement au stimulus vestibulaire seul ou bimodal (Fig. \ref{FIGprotocolmulti} b.), certaines (4) surtout au stimulus bimodal (Fig. \ref{FIGprotocolmulti} c.).
-\subsubsection{Interprétation}
-
\begin{figure}
\centering
\includegraphics[width=\textwidth]{./files/stats3.svg.png}
@@ -169,14 +171,16 @@ \subsubsection{Interprétation}
\label{FIGstatsmultimodal}}
\end{figure}
+\subsubsection{Interprétation}
+
Il semble donc qu'en fonction des poissons l'importance relative des différentes modalités sensorielles dans le contrôle postural soit variable. Pour certains poissons, cependant, la présence simultanée des deux modalités sensorielles semble nécessaire au contrôle postural. Ces données peuvent être interprétées en terme de fréquence moyenne calculée comme le rapport entre la quantité de mouvements de nage et la durée du cycle. Cette métrique inclut les périodes d'inactivité qui suivent un mouvement d'échappement, ce qui fausse légèrement la valeur, comme montré en figure \ref{FIGvariationvitesse}. Les résultats sont présentés en figure \ref{FIGstatsmultimodal} et l'on observe deux phénomènes :
\begin{enumerate}
- \item une larve est capable de moduler son activité en fonction de la force du stimulus
- \item une larve a une réponse accrue en présence de deux stimuli cohérents
+ \item Une larve est capable de moduler son activité en fonction de la force du stimulus.
+ \item Une larve a une réponse accrue en présence de deux stimuli cohérents.
\end{enumerate}
-Ces résultats montrent qu'un réflexe \emph{a priori} vestibulaire comme le contrôle postural est en réalité largement altéré par d'autres modalités sensorielles comme le système visuel. On peut supposer que la sensation tactile, qui permet au poisson de sentir les écoulements de fluide, joue également un rôle (non testé).
+Ces résultats montrent qu'un réflexe \emph{a priori} vestibulaire comme le contrôle postural est en réalité altéré par d'autres modalités sensorielles comme le système visuel. On peut supposer que la sensation tactile, qui permet au poisson de sentir les écoulements de fluide, joue également un rôle (non testé).
Le renforcement multisensoriel peut être interprétée ainsi : pendant les phases unimodales visuelles, les sensations visuelle et vestibulaire sont en conflit, ce qui peut réduire et même supprimer la réponse motrice, la force de cet effet variant d'un poisson à l'autre. Dans les phases unimodales vestibulaires, le poisson ne reçoit aucune information visuelle sur sa position et la réponse comportementale peut être affaiblie par un manque de fiabilité de l'information vestibulaire. Au contraire, pendant les phases de stimulus multimodal cohérent, on remarque une réponse comportementale forte, augmentée par l'intégration multisensorielle.
diff --git a/split/chap2.tex b/split/chap2.tex
index d36fac3..c2e14fd 100644
--- a/split/chap2.tex
+++ b/split/chap2.tex
@@ -22,29 +22,30 @@ \subsubsection{Unité d'illumination}
Un microscope à feuille de lumière par balayage est généralement constitué de deux bras optiques formant un télescope de manière à placer le miroir rotatif galvanométrique de balayage dans le plan congugué de l'échantillon. Ainsi, son mouvement de rotation est transformé en une pure translation du faisceau au niveau de l'échantillon. Ce montage est volumineux et inadapté à un microscope rotatif. Il a donc fallu le miniaturiser et garantir sa stabilité. Les télescopes ont été remplacés par des objectifs de microscope. Le plan de Fourier n'étant pas accessible à cause de la distance frontale arrière, le miroir galvanométrique est légèrement hors du plan conjugué, ce qui introduit une rotation du faisceau dans l'échantillon en plus de la translation. Cette rotation reste cependant faible (<0.4°), et compatible avec une feuille de lumière par balayage.
L'unité d'illumination est composée d'un connecteur de fibre monté sur un positionneur piézoélectrique et de deux objectifs en montage confocal de part et d'autre d'un miroir galvanométrique (Fig. \ref{FIGminiaturelightsheet}).
-\begin{figure}
+\begin{figure}[b]
\centering
- \includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/miniature_light-sheet.svg.png}
- \caption{Schéma extrait de l'article \cite{migault_whole-brain_2018}. Le module miniature peut être monté sur un microscope rotatif. Le poisson est positionné dans l'axe de rotation, et tourné en roulis. L'illumination vient par le côté.
+ \includegraphics[width=0.9\textwidth]{./files/miniature_light-sheet.svg.png}
+ \caption{Module \emph{light-sheet} miniature. Schéma extrait de l'article \cite{migault_whole-brain_2018}. Le module miniature peut être monté sur un microscope rotatif. Le poisson est positionné dans l'axe de rotation, et tourné en roulis. L'illumination vient par le côté.
\label{FIGminiaturelightsheet}}
\end{figure}
\subsubsection{Unité de détection}
-L'enjeu pour une unité de détection rapide est de permettre l'enregistrement avec une durée d'exposition la plus courte possible tout en maintenant un rapport signal à bruit suffisant. Pour collecter beaucoup de lumière, il faut une grande ouverture numérique, et donc une distance de travail faible. Cependant, pour une imagerie à champ large, il faut un grandissement faible. La solution retenue est un objectif Olympus d'ouverture numérique 1 et de grandissement x20. Le grandissement est donné pour une lentille de tube de 180 mm, mais une lentille de tube de 150 mm a été utilisée, ce qui donne donc un grandissement de x16.667. Un pixel de la caméra mesure 6.5 µm, ce qui donne un pixel objet de 0.39 µm. Le capteur CMOS est un carré de 2048 pixels de côté, ce qui donne un champ objet de 0.8 mm. Le champ objet correspond à la longueur du cerveau, mais le pixel objet est très petit par rapport à un neurone. Pour limiter la quantité de données à enregistrer et augmenter le rapport signal à bruit, on peut combiner par les pixels de la caméra, opération appellée \emph{binning}. Cela donne un pixel objet de 0.78 µm.
+L'enjeu pour une unité de détection rapide est de permettre l'enregistrement avec une durée d'exposition la plus courte possible tout en maintenant un rapport signal à bruit suffisant. Pour collecter beaucoup de lumière, il faut une grande ouverture numérique, et donc une distance de travail faible. Cependant, pour une imagerie à champ large, il faut un grandissement faible. La solution retenue est un objectif Olympus d'ouverture numérique 1 et de grandissement x20. Le grandissement est donné pour une lentille de tube de 180 mm, mais une lentille de tube de 150 mm a été utilisée, ce qui donne donc un grandissement de $\times$16.667. Un pixel de la caméra mesure 6.5 µm, ce qui donne un pixel objet de 0.39 µm. Le capteur CMOS est un carré de 2048 pixels de côté, ce qui donne un champ objet de 0.8 mm. Le champ objet correspond à la longueur du cerveau, mais le pixel objet est très petit par rapport à un neurone. Pour limiter la quantité de données à enregistrer et augmenter le rapport signal à bruit, on peut combiner par les pixels de la caméra, opération appellée \emph{binning}. Cela donne un pixel objet de 0.78 µm.
\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/detection_unit.svg.png}
-\caption{Schéma du filtrage spectral dans le bras de détection. Le filtre notch (\emph{encoche}) est très étroit et rejette la longueur d'onde du laser (488 nm). Le filtre GFP et plus large et transmet seulement une bande autour de la fréquence de la GFP (525 nm).}
-% 1e-5 à 488 nm pour GFP
-% 1e-6 à 488 nm pour Notch
-\end{figure}
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/detection_unit.svg.png}
+ \caption{Schéma du filtrage spectral dans le bras de détection. Le filtre notch (\emph{encoche}) est très étroit et rejette la longueur d'onde du laser (488 nm). Le filtre GFP et plus large et transmet seulement une bande autour de la fréquence de la GFP (525 nm).
+ \label{FIGspectralfiltering}}
+ % 1e-5 à 488 nm pour GFP
+ % 1e-6 à 488 nm pour Notch
+ \end{figure}
% OK VolkerComment
% Originally, we did the experiments only with the notch filter. All photons emitted by the fluorophore were then collected which maximizes the signal. The GFP filter helps to block some additionally excited autofluorescence in the tissue. With the GFP filter the notch filter is not really anymore necessary. You can keep your figure but show the real GFP filter transmission spectrum in this case !
-Pour obtenir un bon rapport signal à bruit, il faut réduire la lumière parasite. Une source puissante est le laser d'illumination, elle peut être bloquée spécifiquement avec un filtre coup bande très étroit à sa longueur d'onde. Un filtre GFP (passe-bande à la longueur d'onde de la GFP) permet de filtrer davantage l'autofluorescence des tissus. Après ce filtrage, les bruits restants sont le bruit de photon et le bruit numérique. Le bruit numérique pourrait être réduit avec un système de refroidissement prévu sur la caméra, mais celui-ci est trop encombrant pour le microscope rotatif, et a donc été retiré. Le bruit de photon ne peut être réduit qu'avec des meilleures sondes calciques ou en exposant plus longtemps, mais il est négligeable devant le bruit numérique d'une caméra non refroidie. Le bruit numérique présente une structure liée à la constitution interne du capteur et qui fait apparaître des raies de pixel et la ligne médiale de l'obturateur déroulant.
+Pour obtenir un bon rapport signal à bruit, il faut réduire la lumière parasite. Une source puissante est le laser d'illumination, elle peut être bloquée spécifiquement avec un filtre coup bande très étroit à sa longueur d'onde. Un filtre GFP (passe-bande à la longueur d'onde de la GFP) permet de filtrer davantage l'autofluorescence des tissus (Fig. \ref{FIGspectralfiltering}). Après ce filtrage, les bruits restants sont le bruit de photon et le bruit numérique. Le bruit numérique pourrait être réduit avec un système de refroidissement prévu sur la caméra, mais celui-ci est trop encombrant pour le microscope rotatif, et a donc été retiré. Le bruit de photon ne peut être réduit qu'avec des meilleures sondes calciques ou en exposant plus longtemps, mais il est négligeable devant le bruit numérique d'une caméra non refroidie. Le bruit numérique présente une structure liée à la constitution interne du capteur et qui fait apparaître des raies de pixel et la ligne médiale de l'obturateur déroulant.
% OK VolkerComment
% No! We do not filter out light from light sources in the room! The systems are shielded such that this light does not enter the detection path . The GFP filter filters additional excited autofluorescence.
@@ -53,59 +54,61 @@ \subsubsection{Unité de détection}
\subsubsection{Stabilité mécanique}
-Les deux unités (illumination et détection) d'un poids total inférieur à 2 kg tiennent sur une plaque de 50 cm de côté fixée à un moteur à grand couple et grande précision. Le moteur dispose d'un grand rotor permettant une large zone de fixation qui minimise les déformations mécaniques de la plaque qui soutient le microscope. Nous avons caractérisé précisément l'instabilité liée à la rotation du microscope à l'aide de billes micrométriques fluorescentes.
-
-\begin{figure}
+\begin{figure}[b!]
\centering
\includegraphics[width=0.7\textwidth]{./files/bead_position.svg.png}
\caption{Estimation précise de la position d'une bille fluorescente par balayage vertical du profil radial de sa tache de diffraction.
- \\ a. Image d'une bille dans le plan focal de l'objectif (a1)
- \\ b. Image d'une bille hors du plan focal de l'objectif (b1)
- \\ c. Établissement du profil radial par moyennage autour du centre de gravité de l'image
+ \\ a. Image d'une bille dans le plan focal de l'objectif (a1).
+ \\ b. Image d'une bille hors du plan focal de l'objectif (b1).
+ \\ c. Établissement du profil radial par moyennage autour du centre de gravité de l'image, après retranchement du bruit de fond.
\\ d. Profil cylindrique de la figure de diffraction constitué du profil radial pour plusieurs positions de l'objectif espacées de 20 nm. Les traits pointillés correspondent aux plans (a) et (b). La corrélation verticale du profil cylindrique pour plusieurs positions du microscope donne avec précision le déplacement de la bille.
\label{FIGbeadstability}}
\end{figure}
-Une bille fluorescente de 1 µm est éclairée transversalement par le laser d'excitation, qui coïncide avec le plan focal de l'objectif de détection. Elle est imagée pour plusieurs positions hors focus de l'objectif, ce qui fait apparaître des franges d'interférence. Un profil cylindrique de ces franges est réalisé pour plusieurs positions du microscope et à plusieurs intervalles de temps ce qui permet de mettre en évidence le déplacement latéral et vertical de la bille au cours du temps et en fonction de la position du microscope. Cette technique a l'avantage d'être précise (de l'ordre de 100 nm) et robuste aux variations liées au photoblanchiment. Elle a permis de montrer que lors de la rotation du microscope, le déplacement reste inférieur à 500 nm dans la direction verticale et 2 µm dans la direction latérale (cette dernière peut être corrigée lors de l'analyse comme on le verra plus tard).
+Les deux unités (illumination et détection) d'un poids total inférieur à 2 kg tiennent sur une plaque de 50 cm de côté fixée à un moteur à grand couple et grande précision. Le moteur dispose d'un grand rotor permettant une large zone de fixation qui minimise les déformations mécaniques de la plaque qui soutient le microscope. Nous avons caractérisé précisément l'instabilité liée à la rotation du microscope à l'aide de billes micrométriques fluorescentes.
+
+Une bille fluorescente de 1 µm est éclairée transversalement par le laser d'excitation, qui coïncide avec le plan focal de l'objectif de détection. Elle est imagée pour plusieurs positions hors focus de l'objectif, ce qui fait apparaître des franges d'interférence. Un profil cylindrique de ces franges est réalisé pour plusieurs positions du microscope et à plusieurs intervalles de temps, ce qui permet de mettre en évidence le déplacement latéral et vertical de la bille au cours du temps et en fonction de la position du microscope. Cette technique a l'avantage d'être précise (de l'ordre de 100 nm) et robuste aux variations liées au photoblanchiment. Elle a permis de montrer que lors de la rotation du microscope, le déplacement reste inférieur à 500 nm dans la direction verticale et 2 µm dans la direction latérale (cette dernière peut être corrigée lors de l'analyse comme on le verra plus tard).
+
+\begin{figure}[b!]
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/possible-waist_1P.png}
+ \caption{Demie largeur du profil gaussien à 488 nm dans l'eau pour différentes valeurs du waist. Le trait en pointillé montre le rayon d'un neurone. On cherche à minimiser l'épaisseur du faisceau entre -100 µm à 100 µm. Le trait épais marque la position optimale pour ce critère (les autres profils sont tous plus larges à 100 µm du centre). L'ouverture numérique associée vaut $ \mathrm{NA} = n\sin(\lambda/\pi n w_0) $.
+ \label{FIGoptimalwaist}}
+ \end{figure}
+
+% OK VolkerComment
+% Indicate the NA used for the different curves.
\subsection{Nappe laser par balayage}
\subsubsection{Ouverture numérique optimale}
-Le volume d'un cerveau de larve de poisson zèbre mesure 400 µm de largeur × 800 µm de longueur × 300 µm de hauteur et est situé dans la partie dorsale du corps de la larve. Afin de minimiser l'épaisseur de tissus traversée, on place donc l'objectif de détection sur la partie supérieure. Le laser peut donc être placé sur le côté. Les yeux sont très pigmentés et opaques à la lumière, ce qui crée une zone d'ombre entre les yeux. Certains laboratoires qui sont intéressés par ces régions appartenant au télencéphale et au diencéphale peuvent donc ajouter un deuxième laser à l'avant pour éclairer cette région.
+Le volume d'un cerveau de larve de poisson zèbre mesure 400 µm de largeur × 800 µm de longueur × 300 µm de hauteur et est situé dans la partie dorsale du corps de la larve. Afin de minimiser l'épaisseur de tissus traversée, on place donc l'objectif de détection sur la partie supérieure. Le laser peut donc être placé sur le côté. Les yeux sont très pigmentés et opaques à la lumière, ce qui crée une zone d'ombre entre les yeux. Certains laboratoires qui sont intéressés par ces régions appartenant au télencéphale et au diencéphale peuvent donc ajouter un deuxième laser à l'avant pour éclairer cette région \cite{vladimirov_light-sheet_2014}.
-Pour produire un faisceau laser le plus fin possible sur une longueur de 400 µm, il faut minimiser la largeur après 200 µm de propagation avec comme variable le waist $w_0$ placé au milieu de l'échantillon :
+Pour produire un faisceau laser le plus fin possible sur une longueur de 400 µm, il faut minimiser la largeur à 200 µm du waist suivant la direction de propagation, avec comme variable le waist $w_0$ placé au milieu de l'échantillon :
$$
w(z) = w_0 \, \sqrt{ 1+ {\left( \frac{z}{z_\mathrm{R}} \right)}^2 } \qquad z_\mathrm{R} = \frac{n \pi w_0^2 }{\lambda}
$$
-\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/possible-waist_1P.png}
-\caption{Demie largeur du profil gaussien à 488 nm dans l'eau pour différentes valeurs du waist. Le trait en pointillé montre le rayon d'un neurone. On cherche à minimiser l'épaisseur du faisceau entre -100 µm à 100 µm. Le trait épais marque la position optimale pour ce critère (les autres profils sont tous plus larges à 100 µm du centre). L'ouverture numérique associée vaut $ \mathrm{NA} = n\sin(\lambda/\pi n w_0) $.}
-\end{figure}
-
-% OK VolkerComment
-% Indicate the NA used for the different curves.
-
-Un waist trop petit est trop divergeant, et donc trop large sur les bords, mais un waist trop large limite la résolution. Il faut donc trouver un optimum. La taille d'un neurone étant de 8 µm environ, des valeurs inférieures sont souhaitables.
+Un waist trop petit est trop divergeant, et donc trop large sur les bords, mais un waist trop large limite la résolution. Il faut donc trouver un optimum (Fig. \ref{FIGoptimalwaist}). Le rayon d'un neurone étant de 4 µm environ, des valeurs inférieures sont souhaitables.
Une valeur de waist possible pour un échantillon de 400 µm est de 3 µm à 488 nm et de 5 µm à 915 nm. Pour ces valeurs, la largeur du faisceau à 488 nm vaut 3 µm au centre et 10 µm sur les bords du cerveau. À 915 nm c'est 5 µm au centre et 14 µm sur les bords, mais il faut aussi prendre en compte l'effet deux photons. En pratique, la plupart des neurones (75\% \cite{panier_fast_2013}) sont situés entre -150 µm et +150 µm, la largeur du faisceau aux extrémités n'est donc pas critique.
\subsubsection{Balayage horizontal et vertical}
-Pour effectuer le balayage, on déplace le faisceau horizontalement. Pour que l'intensité soit homogène sur une image, il faut adopter une vitesse de déplacement constante. Il est alors possible de faire un aller simple ou des allers-retours en nombre entier pendant le temps d'exposition. Pour obtenir une image volumétrique, il suffit de répéter l'opération pour plusieurs couches, en changeant le plan focal de l'objectif de détection et la position vertical de la nappe. Procéder de cette manière couche après couche force à attendre entre deux couches pour laisser le temps aux éléments mécaniques de se positionner, ce qui prend un temps (environ 10 ms) non négligeable pour des durées d'exposition courtes. Il est également possible de bouger les éléments mécaniques de manière continue en balayant en aller simple. Les couches sont donc légèrement obliques, mais on gagne considérablement en fréquence d'acquisition. Cela est possible grâce au mode \emph{synchronous readout} de la caméra qui permet de lire les valeurs d'une ligne de pixels tout en exposant une autre.
+Pour effectuer le balayage, on déplace le faisceau horizontalement. Pour que l'intensité soit homogène sur une image, il faut adopter une vitesse de déplacement constante (balayage en dents de scie) et effectuer un nombre entier de passages. Il est donc possible de faire un aller simple ou des allers-retours pendant le temps d'exposition. Pour obtenir une image volumétrique, il suffit de répéter l'opération pour plusieurs couches, en changeant le plan focal de l'objectif de détection et la position vertical de la nappe. Procéder de cette manière couche après couche force à attendre entre deux couches pour laisser le temps aux éléments mécaniques de se positionner, ce qui prend un temps (environ 10 ms) non négligeable pour des durées d'exposition courtes. Il est également possible de bouger les éléments mécaniques de manière continue en balayant en aller simple. Les couches sont donc légèrement obliques, mais on gagne considérablement en fréquence d'acquisition. Cela est possible grâce au mode \emph{synchronous readout} de la caméra qui permet de lire les valeurs d'une ligne de pixels tout en exposant une autre (Fig. \ref{FIGsynchronousreadout}).
\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=0.6\textwidth]{./files/schema_balayage.svg.png}
-\caption{Différents modes de balayage et de lecture du capteur CMOS. Les couches z successives sont représentées à gauche, le capteur (dans le plan xy) est représenté à droite.\\
-a. Balayage par allers-retours lors de l'exposition de tous les pixels, puis lecture de tous les pixels et déplacement à la couche suivante. Le déplacement étant lent, une pause est nécessaire. Pas d'exposition pendant la pause\\
-b. Balayage par aller simple lors de l'exposition, lecture successives des rangées de pixels et ré-exposition immédiate. Le déplacement vertical est continu à vitesse constante, les couches en z sont légèrement obliques. Le cycle exposition-lecture est décalé dans le temps pour chaque rangée de pixels.}
-\end{figure}
-% Add a figure that shows the different scan protocols and that explains the camera readout
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.6\textwidth]{./files/schema_balayage.svg.png}
+ \caption{Différents modes de balayage et de lecture du capteur CMOS. Les couches z successives sont représentées à gauche, le capteur (dans le plan xy) est représenté à droite.\\
+ a. Balayage par allers-retours lors de l'exposition de tous les pixels, puis lecture de tous les pixels et déplacement à la couche suivante. Le déplacement étant lent, une pause est nécessaire. Pas d'exposition pendant la pause\\
+ b. Balayage par aller simple lors de l'exposition, lecture successives des rangées de pixels et ré-exposition immédiate. Le déplacement vertical est continu à vitesse constante, les couches en z sont légèrement obliques. Le cycle exposition-lecture est décalé dans le temps pour chaque rangée de pixels.
+ \label{FIGsynchronousreadout}}
+ \end{figure}
+ % Add a figure that shows the different scan protocols and that explains the camera readout
Pour un temps d'exposition par couche de 10 ms en mode d'acquisition continu, on peut par exemple réaliser un scan du cerveau à 2,5 Hz en 30 couches espacées de 8µm. Cela permet d'imager la majeure partie du cerveau du poisson. Les couches les plus profondes sont moins nettes, car le signal traverse plus de tissus avant d'atteindre l'objectif, et la zone située entre les yeux reste dans l'ombre si on n'utilise qu'un laser. Mais chaque neurone visible est imagé à une fréquence de 2.5 Hz.
@@ -121,7 +124,7 @@ \subsubsection{Balayage horizontal et vertical}
\section{Analyse des données}
-L'analyse des données produites par le microscope est en enjeu en lui-même. En effet, avec des images de 1024$\times$600 pixels, 20 couches et 25 minutes d'enregistrement à 2 volumes par seconde (3000 pas de temps), on obtient 60000 images. Pour des pixels stockés sur 16 bits, cela donne près de 60 Go de données brutes. Dans ce chapitre, je m'intéresse aux stratégies pour traiter ces données. Les chiffres donnés ci-dessus sont ceux utilisés pour les calculs en ordre de grandeur par la suite.
+L'analyse des données produites par le microscope est en enjeu en elle-même. En effet, avec des images de 1024$\times$600 pixels, 20 couches et 25 minutes d'enregistrement à 2 volumes par seconde (3000 pas de temps), on obtient 60000 images. Pour des pixels stockés sur 16 bits, cela donne près de 60 Go de données brutes. Dans ce chapitre, je m'intéresse aux stratégies pour traiter ces données. Les chiffres donnés ci-dessus sont ceux utilisés pour les calculs en ordre de grandeur par la suite.
\subsection{Logiciels existants}
@@ -148,14 +151,15 @@ \subsubsection{Étapes principales de l'analyse de données}
\paragraph{Espace de référence}
-Dans la suite de cette section, j'appellerai de manière équivalente (x,y,z,t) les coordonnées d'un point et les axes dans le repère du poisson. Ces coordonnées sont données dans l'espace de référence RAST (\emph{Right Anterior Superior Time}), c'est-à-dire que l'axe x est orienté vers la droite de la larve, l'axe y vers l'avant, l'axe z vers le haut, et le temps dans le sens naturel.
-
-\begin{figure}
+\begin{figure}[b]
\centering
\includegraphics[width=0.6\textwidth]{./files/RAST.svg.png}
- \caption{Convention d'orientation RAS (a.) et comparaison avec les systèmes de coordonnées naturels de ImageJ (b. coordonnées des pixels d'un écran) et Matlab (c. coordonnées des éléments d'une matrice).}
+ \caption{Convention d'orientation RAS (a.) et comparaison avec les systèmes de coordonnées naturels de ImageJ (b. coordonnées des pixels d'un écran) et Matlab (c. coordonnées des éléments d'une matrice).
+ \label{FIGorientationconvention}}
\end{figure}
+Dans la suite de cette section, j'appellerai de manière équivalente (x,y,z,t) les coordonnées d'un point et les axes dans le repère du poisson. Ces coordonnées sont données dans l'espace de référence RAST (\emph{Right Anterior Superior Time}), c'est-à-dire que l'axe x est orienté vers la droite de la larve, l'axe y vers l'avant, l'axe z vers le haut, et le temps dans le sens naturel (Fig. \ref{FIGorientationconvention}).
+
% OK VolkerComment
% Add a figure illustrating the RAST definition and add your wiki page with the corresponding figures about the different coordinate systems used in Matlab, Fiji, cmtk
@@ -164,11 +168,11 @@ \subsubsection{Étapes principales de l'analyse de données}
% OK VolkerComment
% Start introducing the problem. We have two main problems. Slow thermal drift and fast stimulus induced movements. In addition we have to scope with tissue deformation but normally we discard these runs. Then discuss the different approaches that you developed. Autocorrelation with the first image, autocorrelation with an average image, treatment of all layers independently, estimating the drift per stack based on one layer with good contrast or selecting high contrast landmarks to calculated the drift. Discuss that you developed different approaches: 1. Estimating the fast and slow movements together, 2. Estimating and correcting slow and fast drift sequentially. 3. Correcting the sinusoïdal stimulus induced fast component by hand by applying a sinusoïdal drift correction with user defined amplitude and phase. Make a figure that illustrates the different approaches
-Pour des données à quatre dimensions (x,y,z,t), il est impératif qu'un pixel (x,y,z) représente toujours le même espace objet dans le cerveau. Une première étape consiste donc à aligner toutes les images entre elles. Dans un cas totalement général, le tissu imagé peut connaître des déformations au cours de l'expérience, et il faut estimer et appliquer la transformation inverse. Suite2P et CaImAn fournissent tous les deux des algorithmes de déformation non rigide, mais ces algorithmes sont couteux en temps et il est difficile d'estimer numériquement leur performance. De plus, sur des expériences de vingt minutes, les déformations sont généralement trop faibles pour que cette étape soit réellement nécessaire, nous avons donc opté pour une transformation rigide. Cette transformation rigide peut avoir plusieurs degrés de liberté en translation et rotation. Comme précisé dans la partie sur la conception de la plateforme rotative, nous avons obtenu une excellente stabilité en z, les translations restantes sont donc uniquement selon (x,y), et les rotations sont également négligeables.
+Pour des données à quatre dimensions (x,y,z,t), il est impératif qu'un pixel (x,y,z) représente toujours le même espace objet dans le cerveau. Une première étape consiste donc à aligner toutes les images entre elles. Dans un cas totalement général, le tissu imagé peut connaître des déformations au cours de l'expérience, et il faut estimer et appliquer la transformation inverse. Suite2P et CaImAn implémentent tous les deux des algorithmes de déformation non rigide (phase correlation, NoRMCorre \emph{non rigid motion correction}), mais ces algorithmes sont coûteux en temps et il est difficile d'estimer numériquement leur performance. De plus, sur des expériences de vingt minutes, les déformations sont généralement trop faibles pour que cette étape soit réellement nécessaire, nous avons donc opté pour une transformation rigide. Cette transformation rigide peut avoir plusieurs degrés de liberté en translation et rotation. Comme précisé dans la partie sur la conception de la plateforme rotative, nous avons obtenu une excellente stabilité en z, les translations restantes sont donc uniquement selon (x,y), et les rotations sont également négligeables.
Une difficulté pour trouver cette translation est que l'image peut évoluer le long de l'enregistrement. En effet, en fonction de l'activité des différentes régions, l'image peut se transformer entre le début et la fin de l'expérience à un point suffisant pour empêcher tout algorithme naïf de fonctionner. Dans le cas de l'imagerie monophotonique, le signal de fond est suffisant pour qu'une simple autocorrélation sur l'ensemble de l'image permette de trouver le déplacement. Dans le cas de l'imagerie deux photons, ce signal étant bien plus faible, l'autocorrélation sur l'ensemble de l'image est dominée par les changements de fluorescence liée à l'activité de neurones. La dernière solution retenue a donc été de réaliser l'autocorrélation sur une zone de l'image stable pendant toute la durée de l'expérience facilement identifiable à l'œil. C'est par exemple le cas pour un neurone mort qui reste toujours dépolarisé (on en trouve toujours quelques-uns par volume).
-Cette étape nécessite donc une supervision rapide à l'œil humain mais fonctionne en général du premier coup et est extrêmement rapide par rapport à tout autre algorithme utilisant l'image entière. De plus, il suffit de réaliser l'opération pour une seule couche et d'extrapoler à tout le volume. Cette étape permet de corriger les déplacements latéraux rapides ($x$, $y$) liés directement à la rotation de la plateforme ainsi que la dérive lente en $y$ liée à la contraction du boudin d'agar tenant le poisson.
+Cette étape nécessite donc une supervision rapide à l'œil mais fonctionne en général du premier coup et est extrêmement rapide par rapport à tout autre algorithme utilisant l'image entière. De plus, il suffit de réaliser l'opération pour une seule couche et d'extrapoler à tout le volume. Cette étape permet de corriger les déplacements latéraux rapides ($x$, $y$) liés directement à la rotation de la plateforme ainsi que la dérive lente en $y$ liée à la contraction du boudin d'agar tenant le poisson.
\paragraph{Alignement sur un cerveau de référence}
@@ -182,15 +186,15 @@ \subsubsection{Étapes principales de l'analyse de données}
\paragraph{Analyse de Fourier par pixel}
\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=1\textwidth]{./files/analysis_illustration.svg.png}
-\caption{Différentes étapes de l'analyse.
-\\a. Segmentation par l'algorithme \emph{watershed} affichée par-dessus une image moyenne.
-\\b. Détail de la segmentation. Un extrait du signal du neurone en vert est affiché dessous. Chaque trait léger correspond à un pixel du neurone, le trait épais correspond à la moyenne de tous les pixels pour ce neurone. L'histogramme montre la répartition des tailles des régions pour cette couche. La plupart des segments contiennent entre 20 et 50 pixels.
-\\c. Valeur de signal pour un pixel (le pixel en magenta sur le neurone vert) tout au long de l'enregistrement (le niveau de bruit de la caméra est à 400). Un détail sur la partie encadrée met en évidence son activité périodique.
-\\d. Détail de l'amplitude de la transformée de Fourier discrète du signal précédent. On voit un large pic à la fréquence de stimulation, largement au-dessus du bruit évalué sur une fenêtre avoisinante.
-\label{FIGfourier}}
-\end{figure}
+ \centering
+ \includegraphics[width=1\textwidth]{./files/analysis_illustration.svg.png}
+ \caption{Différentes étapes de l'analyse.
+ \\a. Segmentation par l'algorithme \emph{watershed} affichée par-dessus une image moyenne.
+ \\b. Détail de la segmentation. Un extrait du signal du neurone en vert est affiché dessous. Chaque trait léger correspond à un pixel du neurone, le trait épais correspond à la moyenne de tous les pixels pour ce neurone. L'histogramme montre la répartition des tailles des régions pour cette couche. La plupart des segments contiennent entre 20 et 50 pixels.
+ \\c. Valeur de signal pour un pixel (le pixel en magenta sur le neurone vert) tout au long de l'enregistrement (le niveau de bruit de la caméra est à 400). Un détail sur la partie encadrée met en évidence son activité périodique.
+ \\d. Détail de l'amplitude de la transformée de Fourier discrète du signal précédent. On voit un large pic à la fréquence de stimulation, largement au-dessus du bruit évalué sur une fenêtre avoisinante.
+ \label{FIGfourier}}
+ \end{figure}
% OK VolkerComment
% Add a figure of a typical PSD and show visually how you extract the data
@@ -202,7 +206,7 @@ \subsubsection{Étapes principales de l'analyse de données}
\paragraph{Segmentation et analyse par neurone}
-L'analyse par pixel est pertinente pour des études préliminaires simples, car elle est gourmande en calcul, chaque section de neurone (environ 6 µm de diamètre) étant imagée sur environ 30 pixels (pixel objet de 0.8 µm de côté) (cf histogramme Fig. \ref{FIGfourier} b.). En regroupant les pixels appartenant au même neurone, on peut réduire le volume de données à traiter tout en conservant leur qualité (Fig. \ref{FIGfourier} b.). Il existe de nombreux algorithmes de segmentation, certains faisant appel aux données temporelles pour tirer profit de l'activité des neurones, d'autre opérant sur l'image moyenne. Nous avons pour l'instant uniquement utilisé l'algorithme de ligne de partage des eaux (\emph{watershed}) combiné à une égalisation locale de contraste. Cela donne des résultats satisfaisants comme on le voit en figure \ref{FIGfourier} (a.).
+L'analyse par pixel est pertinente pour des études préliminaires simples, car elle est gourmande en calcul, chaque section de neurone (environ 6 µm de diamètre) étant imagée sur environ 30 pixels (pixel objet de 0.8 µm de côté) (cf histogramme Fig. \ref{FIGfourier} b.). En regroupant les pixels appartenant au même neurone, on peut réduire le volume de données à traiter tout en conservant leur qualité (Fig. \ref{FIGfourier} b.). Il existe de nombreux algorithmes de segmentation, certains faisant appel aux données temporelles pour tirer profit de l'activité des neurones, d'autre opérant sur l'image moyenne. Suite2P utilise la PCA (\emph{Principal Component Analysis}), la SVD (\emph{Single Value Decomposition}) et des algorithmes \emph{custom} ; CaImAn utilise une CNMF (\emph{Coupled Nonnegative Matrix Factorization}). Nous avons pour l'instant uniquement utilisé l'algorithme de ligne de partage des eaux (\emph{watershed}) combiné à une égalisation locale de contraste. Cela donne des résultats satisfaisants comme on le voit en figure \ref{FIGfourier} (a.).
% OK illustrer pixellation du neurone
% OK vérifier taille neurone en pixel
@@ -225,15 +229,15 @@ \subsubsection{Améliorations pratiques et techniques}
Le code utilisé pour l'analyse étant volumineux, sa gestion "génétique" (duplication et mutation) posait problème. J'ai donc mis en place un gestionnaire de version qui a permis d'unir les efforts de développement et de faciliter les mises à jour (correction de bugs, nouvelles fonctionnalités). Son utilisation a eu un effet positif sur la qualité du code, sa réutilisabilité, et sa prise en main.
\paragraph{Support matériel}
-Lors de l'acquisition, \href{https://hcimage.com/}{HCImage} le logiciel édité par Hamamatsu pour l'utilisation de la caméra propose deux options. L'une consiste à enregistrer en mémoire vive les images au cours de l'enregistrement et à les exporter sur le disque à la fin, l'autre consiste à enregistrer un fichier de cache au format propriétaire dcimg directement sur le disque. Dans le premier cas, la vitesse d'enregistrement ne pose pas problème, mais la taille de la mémoire vive est limitée, ce qui ne convient pas pour de longues expériences. Dans le deuxième cas, la vitesse d'enregistrement est limitante pour des images volumineuses avec une fréquence élevée, un disque dur rotatif ne convient pas et nous avons donc utilisé un disque SSD.
+Lors de l'acquisition, \href{https://hcimage.com/}{HCImage} le logiciel édité par Hamamatsu pour l'utilisation de la caméra propose deux options. L'une consiste à enregistrer en mémoire vive les images au cours de l'enregistrement et à les exporter sur le disque à la fin, l'autre consiste à enregistrer un fichier de cache au format propriétaire \verb|dcimg| directement sur le disque. Dans le premier cas, la vitesse d'enregistrement ne pose pas problème, mais la taille de la mémoire vive est limitée, ce qui ne convient pas pour de longues expériences. Dans le deuxième cas, la vitesse d'enregistrement est limitante pour des images volumineuses avec une fréquence élevée, un disque dur rotatif ne convient pas et nous avons donc utilisé un disque SSD.
-\paragraph{Fichier de cache}
-Initialement, ce fichier de cache était converti en une collection d'images au format tiff via HCImage, qui étaient ensuite transférées sur le réseau interne depuis l'ordinateur d'acquisition vers l'ordinateur d'analyse pour enfin être traitées. Les programmes et systèmes de fichiers n'étant pas adaptés à la gestion de si nombreux fichiers, cela occasionnait un surcoût sur le temps de transfert et le temps de copie. Pour résoudre ce problème, nous sommes passés à l'utilisation directe du format dcimg. Après plusieurs tentatives infructueuses d'obtenir de la documentation auprès de l'entreprise Hamamatsu, nous avons opté pour une approche par rétroingénierie (d'autres implémentations plus complètes ont été développées par la suite comme \href{https://github.com/lens-biophotonics/dcimg}{ce module dcimg pour python}).
+\paragraph{Fichier de cache dcimg}
+Initialement, ce fichier de cache était converti en une collection d'images au format tiff via HCImage, qui étaient ensuite transférées sur le réseau interne depuis l'ordinateur d'acquisition vers l'ordinateur d'analyse pour enfin être traitées. Les programmes et systèmes de fichiers n'étant pas adaptés à la gestion de si nombreux fichiers, cela occasionnait un surcoût sur le temps de transfert et le temps de copie. Pour résoudre ce problème, nous sommes passés à l'utilisation directe du format \verb|dcimg|. Après plusieurs tentatives infructueuses d'obtenir de la documentation auprès de l'entreprise Hamamatsu, nous avons opté pour une approche par rétroingénierie (d'autres implémentations plus complètes ont été développées par la suite comme \href{https://github.com/lens-biophotonics/dcimg}{ce module dcimg pour python}).
\paragraph{Memory mapping}
-Il n'est pas envisageable de charger un jeu de données de plus de 60 Go en mémoire vive, il faut donc ouvrir les données au moment de leur utilisation. Pour obtenir une tranche d'un pixel selon (t) sur des images individuelles, il est nécessaire d'ouvrir chacune des images. Le grand nombre d'opérations de fichiers requis peut être réduit en groupant plusieurs pixels, mais au prix d'une perte de simplicité qui rend le code difficile à gérer. La solution retenue est le memory mapping, qui permet de manipuler un fichier sur le disque comme un fichier en mémoire vive, entrainant un gain de simplicité et de performance. De plus, le memory mapping permet de travailler directement sur le fichier de cache, ce qui évite des copies supplémentaires couteuses en espace et en temps.
+Il n'est pas envisageable de charger un jeu de données de plus de 60 Go en mémoire vive, il faut donc ouvrir les données au moment de leur utilisation. Pour obtenir une tranche d'un pixel selon (t) sur des images individuelles, il est nécessaire d'ouvrir chacune des images. Le grand nombre d'opérations de fichiers requis peut être réduit en groupant plusieurs pixels, mais au prix d'une perte de simplicité qui rend le code difficile à gérer. La solution retenue est le memory mapping, qui permet de manipuler un fichier sur le disque comme un fichier en mémoire vive, entrainant un gain de simplicité et de performance. De plus, le memory mapping permet de travailler directement sur le fichier de cache, ce qui évite des copies supplémentaires coûteuses en espace et en temps.
-Le memory mapping peut être combiné à l'allocation de mémoire disque pour être utilisé au moment de l'écriture. Cela facilite la manipulation des données par rapport à une écriture séquentielle dans un fichier binaire, et permet la modification d'une partie du fichier et la parallélisation de l'écriture. Pour cela, j'ai utilisé la fonction système \verb|fallocate| qui alloue de l'espace sur un disque formaté en \verb|ext4|.
+Le \verb|memory mapping| peut être combiné à l'allocation de mémoire disque pour être utilisé au moment de l'écriture. Cela facilite la manipulation des données par rapport à une écriture séquentielle dans un fichier binaire, et permet la modification d'une partie du fichier et la parallélisation de l'écriture. Pour cela, j'ai utilisé la fonction système \verb|fallocate| qui alloue de l'espace sur un disque formaté en \verb|ext4|.
\paragraph{Calcul du quantile glissant}
Une définition courante de la valeur de référence d'un signal calcique repose sur le calcul d'un quantile glissant (le huitième centile \cite{dombeck_imaging_2007}). L'algorithme naïf qui consiste à calculer le quantile sur chaque fenêtre est inefficace ($\mathcal{O}(n^2)$), j'ai donc cherché une implémentation astucieuse et ai trouvé la fonction \verb|runquantile| de la bibliothèque \verb|caTools|, qui a apporté un gain en vitesse par rapport à l'implémentation précédente. Cette implémentation repose sur le tri par insertion mais retient le tri effectué sur la fenêtre précédente, ce qui lui permet d'atteindre une complexité en $\mathcal{O}(n\times k)$, où $n$ est le nombre de valeurs et $k$ la taille de la fenêtre.
@@ -249,7 +253,7 @@ \subsubsection{Améliorations pratiques et techniques}
\subsubsection{Pistes d'améliorations}
\paragraph{Ordre des dimensions}
-L'ordre naturel des dimensions en mémoire est l'ordre obtenu lors de l'écriture ($(x,y),z,t$). Cet ordre permet de lire et écrire rapidement une image, mais n'est pas adapté à une tranche selon $t$. En effet les valeurs à deux instant successifs pour un même pixel ($x,y,z$) sont séparées en mémoire de 12 288 000 valeurs. Lire une tranche temporelle est extrêmement long sur un disque dur rotatif et reste limitant sur un SSD. Un gain de vitesse pour des tranches temporelles peut être obtenu en permutant l'ordre des dimensions en mémoire, au prix d'une perte pour la lecture d'images (tranche $(x,y)$). Pour un ordre ($t,x,y,z$), la vitesse de lecture des images reste suffisamment rapide pour un affichage à fréquence vidéo tout en accélérant immensément la lecture de tranches temporelles, bien plus sollicitée lors de l'analyse. Réaliser ce changement nécessite la ré-écriture d'une grande part du code actuel.
+L'ordre naturel des dimensions en mémoire est l'ordre obtenu lors de l'écriture ($(x,y),z,t$). Cet ordre permet de lire et écrire rapidement une image, mais n'est pas adapté à une tranche selon $t$. En effet les valeurs à deux instant successifs pour un même pixel ($x,y,z$) sont séparées en mémoire de 12 288 000 valeurs. Lire une tranche temporelle est extrêmement long sur un disque dur rotatif et reste limitant sur un SSD. Un gain de vitesse pour des tranches temporelles peut être obtenu en permutant l'ordre des dimensions en mémoire, au prix d'une perte pour la lecture d'images (tranche $(x,y)$). Pour un ordre ($t,x,y,z$), la vitesse de lecture des images reste suffisamment rapide pour un affichage à fréquence vidéo tout en accélérant immensément la lecture de tranches temporelles, bien plus sollicitée lors de l'analyse.
% TODO ressortir les benchmarks ordre dimensions
@@ -259,7 +263,7 @@ \subsubsection{Pistes d'améliorations}
% TODO estimer la taille de la ROI sur plusieurs runs
\paragraph{Langage adapté}
-Les amélioration que je propose impliquent beaucoup de ré-écriture de code, c'est donc l'occasion de se poser des questions sur le langage à utiliser. Le code actuel est en Matlab, un langage qui n'est pas très adapté à la gestion de ce type de données. Changer pour un langage plus complet permettrait de gérer des données sur 12bits, d'écrire de manière plus modulaire, et autres avantages que je discute plus précisément en annexe \ref{langageadapte}.
+Les amélioration que je propose impliquent beaucoup de ré-écriture de code, c'est donc l'occasion de se poser des questions sur le langage à utiliser. Le code actuel est en Matlab, un langage qui n'est pas très adapté à la gestion de ce type de données. Changer pour un langage plus complet permettrait de changer simplement l'ordre des dimensions, de gérer des données sur 12bits, d'écrire de manière plus modulaire, de faciliter la maintenance, et autres avantages que je discute plus précisément en annexe \ref{langageadapte}.
% (ancien paragraphe)
% Jusque-là, une grande partie des données ont été analysées en langage Matlab. Ce langage n'est pas très adapté à la gestion de données de ce type et souffre de plusieurs lacunes. Matlab est généralement lent, ce qui est handicapant. Matlab n'accepte de données que sur 8, 16, 32, ou 64 bits, ce qui interdit l'amélioration consistant à encoder les données sur 12 bits. Matlab est mauvais pour réaliser un système modulaire, ce qui augmente dramatiquement les efforts pour maintenir un programme. Matlab est fermé, opaque, et sous licence propriétaire, ce qui diminue les possibilités d'utilisation du code.
@@ -295,40 +299,40 @@ \subsection{Résultats}
\subsubsection{Carte de réponse}
\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=0.95\textwidth]{./files/Migault_et-al_Fig4.jpg}
-\caption{\label{FIGMigault4}}
-\end{figure}
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.95\textwidth]{./files/Migault_et-al_Fig4.jpg}
+ \caption{\label{FIGMigault4}}
+ \end{figure}
\addtocounter{figure}{-1}
\begin{figure}
-\caption{
-Figure extraite du papier de Migault \emph{et al} \cite{migault_whole-brain_2018}. Cartes de la réponse fonctionnelle à une stimulation vestibulaire en roulis. Poisson paralysé exprimant le rapporteur GCaMP6s dans le noyau des neurones (elavl3:H2B-GCaMP6s).
-\\\textbf{A}. Haut : réponse par neurone en coordonnées polaires. Quatre zones sont identifiées en niveau de gris (i, ii, iii, iv). La couleur indique le déphasage avec le stimulus. La ligne en pointillé indique la position attendue d'un signal à déphasage nul après correction du délai dû à un rapporteur GCaMP6s. Bas : schéma d'un cycle de stimulus, les flèches montrent le pic d'activité des neurones dont la réponse est la plus forte (en tenant en compte le délai du rapporteur calcique).
-\\\textbf{B}. Haut : dix couches de la carte pour une réponse typique après alignement sur le cerveau de référence Z-Brain. Bas : agrandissement des zones encadrées par les rectangles.
-\\\textbf{C}. Fraction des neurones répondant parmi les treize zones sélectionnées colorés selon leur phase.
-\\\textbf{D}. Projection maximale horizontale (moitié gauche seulement) et verticale (cerveau entier) de la carte montrée en B. pour les quatre intervalles de phase identifiés en A.
-\\\textbf{E}. Comme C. mais en moyenne sur huit poissons.
-\\\textbf{F}. Projection maximale horizontale et verticale de la carte moyennée pour huit poissons (gauche) et neuf poissons énucléés (droite).
-\\Abbréviations : \emph{Orientation} \textbf{Ro} rostral, \textbf{C} caudal, \textbf{D} dorsal, \textbf{V} ventral, \textbf{L} left, \textbf{R} right,
-\\\emph{Régions} \textbf{Hab} habenula, \textbf{IO} inferior olive, \textbf{TL} torus longitudinalis, \textbf{Teg} tegmentum, \textbf{nMLF} nuclear medial fasciculus, \textbf{nIII} oculomotor nucleus, \textbf{nIV} trochlear nucleus, \textbf{Cer} cerebellum, \textbf{Rh} rhombomere
-}
-\end{figure}
+ \caption{
+ Figure extraite du papier de Migault \emph{et al} \cite{migault_whole-brain_2018}. Cartes de la réponse fonctionnelle à une stimulation vestibulaire en roulis. Poisson paralysé exprimant le rapporteur GCaMP6s dans le noyau des neurones (elavl3:H2B-GCaMP6s).
+ \\\textbf{A}. Haut : réponse par neurone en coordonnées polaires. Quatre zones sont identifiées en niveau de gris (i, ii, iii, iv). La couleur indique le déphasage avec le stimulus. La ligne en pointillé indique la position attendue d'un signal à déphasage nul après correction du délai dû à un rapporteur GCaMP6s. Bas : schéma d'un cycle de stimulus, les flèches montrent le pic d'activité des neurones dont la réponse est la plus forte (en tenant en compte le délai du rapporteur calcique).
+ \\\textbf{B}. Haut : dix couches de la carte pour une réponse typique après alignement sur le cerveau de référence Z-Brain. Bas : agrandissement des zones encadrées par les rectangles.
+ \\\textbf{C}. Fraction des neurones répondant parmi les treize zones sélectionnées colorés selon leur phase.
+ \\\textbf{D}. Projection maximale horizontale (moitié gauche seulement) et verticale (cerveau entier) de la carte montrée en B. pour les quatre intervalles de phase identifiés en A.
+ \\\textbf{E}. Comme C. mais en moyenne sur huit poissons.
+ \\\textbf{F}. Projection maximale horizontale et verticale de la carte moyennée pour huit poissons (gauche) et neuf poissons énucléés (droite).
+ \\Abbréviations : \emph{Orientation} \textbf{Ro} rostral, \textbf{C} caudal, \textbf{D} dorsal, \textbf{V} ventral, \textbf{L} left, \textbf{R} right,
+ \\\emph{Régions} \textbf{Hab} habenula, \textbf{IO} inferior olive, \textbf{TL} torus longitudinalis, \textbf{Teg} tegmentum, \textbf{nMLF} nuclear medial fasciculus, \textbf{nIII} oculomotor nucleus, \textbf{nIV} trochlear nucleus, \textbf{Cer} cerebellum, \textbf{Rh} rhombomere
+ }
+ \end{figure}
On voit sur la figure \ref{FIGMigault4} les cartes de réponse fonctionnelle du cerveau de larve pour une stimulation vestibulaire en roulis. La carte présente bien une antisymétrie bilatérale : les neurones de l'hémisphère gauche sont actifs en opposition de phase par rapport à ceux de l'hémisphère droit. Les neurones coactifs temporellement semblent être organisés en groupes colocalisés spatialement, ce qui dégage plusieurs groupes fonctionnels également symétriques.
Ces groupes sont situés dans le tegmentum, le nMLF, le noyau oculomoteur (dans le mésencéphale (nIII) et dans le rhombencéphale (nIV)), le noyau octavolatéral, le noyau vestibulaire tangantiel, le noyau vestibulo-spinal, le rhombomère 7, et l'olive inférieure. Dans d'autres régions l'activité est plus éparse : le torus longitudinalis, l'habenula, le tectum optique, le cerebellum.
\subsubsection{Déphasage de GCaMP6s}
-\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/chen2013_GCaMP6.svg.png}
-\caption{Graphiques extraits de Chen \emph{et al} \cite{chen_ultrasensitive_2013}
-montrant la réponse à un train de potentiels d'action pour le rapporteur calcique GCaMP6 exprimé dans le cytoplasme pour ses trois versions (slow (s), medium (m), fast (f)). Le modèle en montée instantanée et en déclin exponentiel est ajouté sur (a.) ($\tau$ = 0.27, 0.73, 1.0) et sur (b.) ($\tau$ = 0.4, 1.16, 1.81). Les valeurs correspondent à une lecture graphique de (d.).
-\label{FIGcalciumkernel}}
-\end{figure}
+\begin{figure}[b!]
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/chen2013_GCaMP6.svg.png}
+ \caption{Graphiques extraits de Chen \emph{et al} \cite{chen_ultrasensitive_2013}
+ montrant la réponse à un train de potentiels d'action pour le rapporteur calcique GCaMP6 exprimé dans le cytoplasme pour ses trois versions (slow (s), medium (m), fast (f)). Le modèle en montée instantanée et en déclin exponentiel est ajouté sur (a.) ($\tau$ = 0.27, 0.73, 1.0) et sur (b.) ($\tau$ = 0.4, 1.16, 1.81). Les valeurs correspondent à une lecture graphique de (d.).
+ \label{FIGcalciumkernel}}
+ \end{figure}
-On trouve des neurones à toutes les valeurs de déphasage possible, mais la plupart se situent à des valeurs de -$\pi$/8 et son symétrique, 7$\pi$/8. Cette valeur représente le décalage entre le stimulus sinusoïdal et la fluorescence mesurée. Par exemple, un déphasage de zéro correspond à un signal maximum lorsque la valeur de l'angle est maximale, c'est-à-dire une larve inclinée de 10° vers la droite. Toutefois, cela ne représente pas directement l'activité du neurone. En effet, il faut prendre en compte le décalage dû à la constante de temps du rapporteur calcique. En figure \ref{FIGcalciumkernel}, on montre la réponse d'un rapporteur calcique dans un neurone en fonction du nombre de potentiels d'action. On remarque que le modèle en déclin exponentiel résume bien la réponse dans la plupart des cas, on peut donc ignorer le temps de montée. Cependant, le temps de relaxation caractéristique évolue significativement entre un seul potentiel d'action et cent potentiels d'action sans montrer de phénomène de pallier. Pour estimer le déphasage lié à la réponse du rapporteur calcique, nous avons enregistré l'activité spontanée des neurones pour plusieurs poissons et appliqué l'algorithme de déconvolution aveugle développé par Tubiana \emph{et al} \cite{tubiana_blind_2017} qui a estimé un temps de relaxation de $\tau_\text{H2B-GCaMP6s-Nuclear} = 3.5 \pm 0.7 s$. Avec cette valeur de $\tau$ on approche le noyau du rapporteur calcique par :
+On trouve des neurones à toutes les valeurs de déphasage possible, mais la plupart se situent à des valeurs de -$\pi$/8 et son symétrique, 7$\pi$/8. Cette valeur représente le décalage entre le stimulus sinusoïdal et la fluorescence mesurée. Par exemple, un déphasage de zéro correspond à un signal maximum lorsque la valeur de l'angle est maximale, c'est-à-dire une larve inclinée de 10° vers la droite. Toutefois, cela ne représente pas directement l'activité du neurone. En effet, il faut prendre en compte le décalage dû à la constante de temps du rapporteur calcique. En figure \ref{FIGcalciumkernel}, on montre la réponse d'un rapporteur calcique dans un neurone en fonction du nombre de potentiels d'action. On remarque que le modèle en déclin exponentiel résume bien la réponse dans la plupart des cas, on peut donc ignorer le temps de montée. Cependant, le temps de relaxation caractéristique évolue significativement entre un seul potentiel d'action et cent potentiels d'action sans montrer de phénomène de pallier. Pour estimer le déphasage lié à la réponse du rapporteur calcique, nous avons enregistré l'activité spontanée des neurones pour plusieurs poissons et appliqué l'algorithme de déconvolution aveugle développé par Tubiana \emph{et al} \cite{tubiana_blind_2017} qui a estimé un temps de relaxation de $\tau_\text{H2B-GCaMP6s-Nuclear} = 3.5 \pm 0.7 s$. Avec cette valeur de $\tau$ on approche le noyau $K(t)$ du rapporteur calcique par la forumle ($H$ fonction de Heaviside) :
$$
K(t) = \frac{1}{\tau}\exp\left(-\frac{t}{\tau}\right)H(t)
@@ -348,15 +352,16 @@ \section{Stimulation en tangage}\label{SECTIONtiltmicroscope1P}
\subsection{Description du montage}
-\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/miniature_light-sheet_tilt.svg.png}
-\caption{Microscope rotatif conçu pour la stimulation en tangage.
-\\a. Module de balayage adapté avec un miroir fixe. La fibre arrive dans la même direction que l'axe de rotation.
-\\b. Schéma du montage. L'unité d'illumination est fixée sur une plaque optique qu'elle traverse. La fibre arrive par derrière la nappe laser ressort par devant, du côté de l'échantillon. Le module de détection est fixé par-dessus l'échantillon.
-\\c. Un système bielle-manivelle entraîne la plaque optique fixée à un roulement annulaire. La position de l'axe moteur (O) est réglable et permet une oscillation sinusoïdale (au niveau de B, la longueur OA permet de régler l'amplitude) ou un mouvement circulaire (au niveau de C, avec une manivelle de longueur BC). La stabilité du système en fonction de l'angle est indiquée en encart.
-\label{FIGtiltlightsheet}}
-\end{figure}
+\begin{figure}[b!]
+ \centering
+ \includegraphics[width=\textwidth]{./files/miniature_light-sheet_tilt.svg.png}
+ \caption{Microscope rotatif conçu pour la stimulation en tangage.
+ \\a. Module de balayage adapté avec un miroir fixe. La fibre arrive dans la même direction que l'axe de rotation.
+ \\b. Schéma du montage. L'unité d'illumination est fixée sur une plaque optique qu'elle traverse. La fibre arrive par derrière la nappe laser ressort par devant, du côté de l'échantillon. Le module de détection est fixé par-dessus l'échantillon.
+ \\c. Un système bielle-manivelle entraîne la plaque optique fixée à un roulement annulaire. La position de l'axe moteur (O) est réglable et permet une oscillation sinusoïdale (au niveau de B, la longueur OA permet de régler l'amplitude) ou un mouvement circulaire (au niveau de C, avec une manivelle de longueur BC).
+ \\d. Stabilité du système caractérisée par la méthode décrite en figure \ref{FIGbeadstability}.
+ \label{FIGtiltlightsheet}}
+ \end{figure}
Pour une stimulation en tangage, le poisson doit être placé perpendiculairement à l'axe de rotation, avec les deux oreilles internes sur l'axe. Le laser devant arriver par le côté, le module de balayage a été adapté avec un miroir fixe pour que la direction d'entrée et de sortie soient parallèles. Ainsi, la fibre peut être placée le long de l'axe de rotation, ce qui minimise ses déformations.
@@ -367,12 +372,12 @@ \subsection{Description du montage}
\subsection{Carte de réponse comparée}
\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=\textwidth]{./files/tilt_roll.svg.png}
-\caption{Cartes de réponses obtenues pour une stimulation de rotation sinusoïdale selon l'axe de roulis (a, premier microscope) et de tangage (b, second microscope). On remarque que la carte est antisymétrique dans le cas du roulis et symétrique dans le cas du tangage.
-Pour le roulis, la vue de côté est réalisée sur la moitié gauche du volume seulement.
-\label{FIGtiltroll}}
-\end{figure}
+ \centering
+ \includegraphics[width=\textwidth]{./files/tilt_roll.svg.jpg}
+ \caption{Cartes de réponses obtenues pour une stimulation de rotation sinusoïdale selon l'axe de roulis (a, premier microscope) et de tangage (b, second microscope). On remarque que la carte est antisymétrique dans le cas du roulis et symétrique dans le cas du tangage.
+ Pour le roulis, la vue de côté est réalisée sur la moitié gauche du volume seulement.
+ \label{FIGtiltroll}}
+ \end{figure}
En figure \ref{FIGtiltroll}, je montre côte à côte une des cartes de réponse en roulis présentées dans la section précédente et une carte en tangage obtenue sur ce second microscope (en acquisition un photon). L'observation la plus évidente est que la carte en tangage présente une symétrie bilatérale. En effet, les deux utricules sont activés exactement en même temps avec la même amplitude par la rotation de la larve. Les phases les plus représentées (rouge et cyan) sont les mêmes que pour la carte en roulis, ce qui confirme que les neurones sont excités par le même type de stimulation (mélange de vitesse et de position). La zone qui présente le plus d'activité est également le noyau oculomoteur nIII et nIV. On distingue cependant une différence avec la carte en roulis : alors que tous les neurones situés du même côté du tegmentum sont en phase dans la stimulation en roulis, on remarque deux zones en opposition de phase dans la simulation en tangage. Ces deux zones peuvent être séparées en deux par un plan horizontal. La zone dorsale recouvre à la fois le nMLF, et le noyau oculomoteur nIII et nIV. La zone ventrale recouvre surtout le nMLF et nIII. Des zones plus rostrales semblent aussi actives comme un cluster de neurones glutamatergiques du mésencéphale (région 111 de l'atlas zbrain) et une bande d'oligodendrocytes du diencéphale (région 043 de l'atlas zbrain). Cela est cohérent avec les connaissances actuelles sur les neurones oculomoteurs \cite{schoppik_gaze-stabilizing_2017} et l'activation des muscles oculaires pendant le VOR.
@@ -383,4 +388,6 @@ \subsection{Carte de réponse comparée}
\subsection{Conclusion}
-Ce nouveau microscope a permis de réaliser la cartographie du cerveau en réponse à une stimulation vestibulaire en tangage en répondant aux exigences de stabilité. Toutefois, avant de s'en servir pour réaliser un environnement de réalité virtuelle capable de reproduire les expériences présentées en partie \ref{chapII}, il faut gagner le contrôle sur l'environnement visuel et passer d'une excitation un photon à une excitation deux photons. C'est l'objectif du chapitre suivant, dans lequel je présente les enjeux d'une feuille de lumière deux photons rotative et les solutions techniques mises en œuvre pour la réaliser.
\ No newline at end of file
+Ce nouveau microscope a permis de réaliser la cartographie du cerveau en réponse à une stimulation vestibulaire en tangage en répondant aux exigences de stabilité. Cette carte révèle des similarités et des différences. Comme pour une rotation en roulis, la rotation en tangage déplace les utricules et stimule le circuit vestibulaire, entraînant des mouvements compensatoires des yeux. Les mêmes zones du cerveau sont activées, ce que j'ai pu vérifier. Cependant, au contraire d'une rotation en roulis qui stimule les utricules de manière antisymétrique, la rotation en tangage stimule les utricules de manière symétrique. Cette caractéristique de la stimulation se retrouve dans l'activité neuronale : le cerveau présente une symétrie bilatérale et son activité traduit les stimuli auxquels le système sensoriel est soumis. La stimulation en tangage a également permis de distinguer des régions du noyau oculomoteur qui paraissaient rassemblées en roulis. Ces neurones moteurs sont en effet responsables de l'activation des muscles extra-oculaires droits médians, droits latéraux, droits supérieurs, droits inférieurs, obliques inférieurs et obliques supérieurs \cite{straka_vestibular_2013}\cite{straka_connecting_2014}.
+
+Avant de se servir de ce microscope dans un environnement de réalité virtuelle capable de reproduire les expériences présentées en chapitre \ref{chapII}, il faut gagner le contrôle sur l'environnement visuel et passer d'une excitation un photon à une excitation deux photons. C'est l'objectif du chapitre \ref{chapIII}, dans lequel je présente les enjeux d'une feuille de lumière deux photons rotative et les solutions techniques mises en œuvre pour la réaliser.
\ No newline at end of file
diff --git a/split/chap3.tex b/split/chap3.tex
index a7d2ccc..d939d06 100644
--- a/split/chap3.tex
+++ b/split/chap3.tex
@@ -66,7 +66,7 @@
% TODO VolkerComment2
% Discuss the paper: They demonstrated lower visual response threshold in 2P LSM compared to 1P LSM. Show the figure 1b of Wolf et al. Discuss also that one cannot image through the eyes as this will burn the fish.
-Pour étudier le cerveau lors du contrôle postural, il est donc nécessaire de réaliser un microscope rotatif deux photons, ce qui soulève plusieurs enjeux techniques. D'une part, pour guider le laser deux photons vers une plateforme mobile, il faut disposer d'une fibre adaptée (transmission de grandes puissances, faible dispersion, maintient de la polarisation, faible gain de courbure), d'autre part il faut minimiser les effets dus à la propagation d'un faisceau intense dans un fluide mobile. Ce chapitre débute sur les fibres optiques adaptées à la transmission d'un laser deux photons et leur utilisation en microscopie embarquée, et poursuit sur la construction d'un microscope deux photons rotatif fibré.
+Pour étudier le cerveau lors du contrôle postural, il est donc nécessaire de réaliser un microscope rotatif deux photons, ce qui soulève plusieurs enjeux techniques. D'une part, pour guider le laser deux photons vers une plateforme mobile, il faut disposer d'une fibre adaptée (transmission de grandes puissances, faible dispersion, maintient de la polarisation, faible gain de courbure), d'autre part il faut minimiser les effets dus à la propagation d'un faisceau intense dans un fluide en mouvement. Ce chapitre débute sur les fibres optiques adaptées à la transmission d'un laser deux photons et leur utilisation en microscopie embarquée, et poursuit sur la construction d'un microscope deux photons rotatif fibré.
% TOOD VolkerComment2
% (grandes puissances)
@@ -81,14 +81,13 @@ \subsection{Principe}
\subsection{Concentration spatiale}
-\begin{figure}
+\begin{figure}[p]
\centering
\includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/profile-intensity.png}
- \caption{Effet deux-photons en microscopie à feuille de lumière. Comparaison du profil d'intensité (haut) et de son carré (bas). On voit que la zone concernée par l'effet deux photons et restreinte. (paramètres : indice optique 1.33, longueur d'onde 915 nm, waist 6.5 µm)
- }
+ \caption{Effet deux-photons en microscopie à feuille de lumière. Comparaison du profil d'intensité (haut) et de son carré (bas). On voit que la zone concernée par l'effet deux photons et restreinte. (paramètres : indice optique 1.33, longueur d'onde 915 nm, waist 6.5 µm)}
\label{2P-intensity-profile}
\end{figure}
-
+
Un système optique peut concentrer la lumière localement, ce qui produit un point de plus grande intensité, le point focal. Comme l'effet deux photons est proportionnel au carré de l'intensité, la zone concernée est d'autant plus restreinte. Cette propriété est utilisée en microscopie multiphoton pour produire une illumination ponctuelle qui permet le sectionnement optique dans la direction de propagation. En microscopie à feuille de lumière, au contraire, une illumination linéaire est recherchée. La focalisation est donc bien moindre et l'effet deux photons contribue à affiner la zone d'excitation, la fluorescence n'étant excitée qu'au centre du faisceau (Fig. \ref{2P-intensity-profile}).
% TODO VolkerComment2
@@ -97,7 +96,7 @@ \subsection{Concentration spatiale}
\subsection{Concentration temporelle}\label{SECTIONconcentrationtemporelle}
-\begin{figure}
+\begin{figure}[p]
\centering
\includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/pulsed_laser.svg.png}
\caption{Profil temporel de puissance d'un laser pulsé. Chaque impulsion a une durée $\tau$, elles sont espacées d'une durée T=1/f. À puissance moyenne constante, plus $\tau$ est petit, et plus T est grand, plus $P_\text{max}$ est grand. L'effet deux photons est proportionnel au carré de $P_\text{max}$.
@@ -105,7 +104,7 @@ \subsection{Concentration temporelle}\label{SECTIONconcentrationtemporelle}
\label{pulsed-laser}
\end{figure}
-Une autre manière de concentrer la lumière est la concentration temporelle. Dans le cas d'un laser continu, la puissance est répartie sur toute la longueur de propagation du faisceau. En utilisant un laser pulsé, la puissance est concentrée en paquets beaucoup plus courts (Fig. \ref{pulsed-laser}). Par exemple, pour des impulsions de 100 fs, malgré la vitesse élevée de la lumière, la longueur de ces paquets est de 30 mm. Si de plus le taux de répétition du laser est de 80 MHz, la puissance d'une impulsion est 125 fois plus élevée qu'un laser continu de même puissance moyenne (1/(100fs x 80MHz)). L'effet deux photons étant proportionnel au carré de la puissance instantanée, on a intérêt à choisir les impulsions les plus courtes possibles (petit $\tau$) et le taux de répétition le plus faible possible (grand T) pour un laser de puissance moyenne fixée \cite{maioli_fast_2020}. Cette tendance est limitée par les photoperturbations induites, qui deviennent importantes au-delà d'une centaine de nanojoules par impulsion. Les conditions optimales en microscopie par fluorescence à nappe laser deux photons sont donc autour de f = 1 MHz, $\tau$ = 100 fs, P = 100 mW, ce que confirme Gasparoli \emph{et al} \cite{gasparoli_is_2020}. % TODO préciser
+Une autre manière de concentrer la lumière est la concentration temporelle. Dans le cas d'un laser continu, la puissance est répartie sur toute la longueur de propagation du faisceau. En utilisant un laser pulsé, la puissance est concentrée en paquets beaucoup plus courts (Fig. \ref{pulsed-laser}). Par exemple, pour des impulsions de 100 fs, malgré la vitesse élevée de la lumière, la longueur de ces paquets est de 30 mm. Si de plus le taux de répétition du laser est de 80 MHz, la puissance d'une impulsion est 125 fois plus élevée qu'un laser continu de même puissance moyenne (1/(100 fs $\times$ 80 MHz)). L'effet deux photons étant proportionnel au carré de la puissance instantanée, on a intérêt à choisir les impulsions les plus courtes possibles (petit $\tau$) et le taux de répétition le plus faible possible (grand T) pour un laser de puissance moyenne fixée \cite{maioli_fast_2020}. Cette tendance est limitée par les photoperturbations induites, qui deviennent importantes au-delà d'une centaine de nanojoules par impulsion. Les conditions optimales en microscopie par fluorescence à nappe laser deux photons sont autour de f = 1 MHz, $\tau$ = 100 fs, P = 100 mW \cite{gasparoli_is_2020}.
% TODO VolkerComment2
% Move this to the discussion. Also from where do you get the numbers? citation is missing. Willy Supatto shows in his 2020 paper that 10MHz is the optimal repetition rate.
@@ -147,7 +146,7 @@ \subsubsection{Fibres à cristaux photoniques}
Une autre idée consiste à utiliser un phénomène de réflexion par interférences comme le miroir de Bragg. Un tel miroir est constitué d'une succession périodique de couches d'indice différents et permet d'obtenir une réflexion quasi totale à la longueur d'onde du motif. Différents modèles sont illustrés en figure \ref{FIGfiberexamples}.
\paragraph{Fibres à réseaux de tubes}
-On trouve ce genre de réseau pour la première fois en 1999 sous forme de fibre à cristaux photoniques \cite{cregan_single-mode_1999} ou plus tard sous la forme de fibre microstructurées \cite{argyros_hollow-core_2006}. En 2010, Vincetti \emph{et al} montrent par analyse numérique que seule la première couche de tubes joue un rôle important dans les propriétés de ces fibres \cite{vincetti_waveguiding_2010}. Ce qui donne des fibres constituées d'un seul réseau de tube.
+On trouve ce genre de réseau pour la première fois en 1999 sous forme de fibres à cristaux photoniques \cite{cregan_single-mode_1999} ou plus tard sous la forme de fibres microstructurées \cite{argyros_hollow-core_2006}. En 2010, Vincetti \emph{et al} montrent par analyse numérique que seule la première couche de tubes joue un rôle important dans les propriétés de ces fibres \cite{vincetti_waveguiding_2010}. Ce qui donne des fibres constituées d'un seul réseau de tube.
\paragraph{Fibres à motif Kagomé}
L'idée du réseau de diffraction a également donné lieu aux fibres à réseau trihexagonal, ou "Kagomé". De telles fibres ont été construites pour la première fois en 2002 sous le nom de fibre à cristaux photoniques. Le gain était alors de l'ordre de 2 dB/m \cite{benabid_stimulated_2002}. En 2011, un gain de 180 dB/km a été obtenu avec de telles fibres \cite{wang_low_2011}.
@@ -168,7 +167,7 @@ \subsection{Utilisation des fibres en microscopie embarquée}
% Dans un microscope statique, la source laser peut être guidée jusqu'à l'échantillon par des miroirs, mais dans un microscope mobile il faut soit embarquer la source laser directement sur le microscope, soit la guider de manière flexible quelques soient les mouvements. Dans le cas d'une source laser deux photons très volumineuse, il est impossible de l'embarquer, la solution adoptée est donc une fibre optique adaptée. De telles fibres optiques capables de guider un laser deux photons sont complexes à produire. Avant de nous intéresser aux microscopes à fibre couramment utilisés dans la recherche sur le rongeur, introduisons les caractéristiques d'un guide d'onde.
-Les propriétés de guidage de la lumière d'une fibre optique lui permettent d'alléger considérablement ou de déporter certaines parties des microscopes pour les rendre compatibles avec l'imagerie embarquée. Un microscope est en effet composé d'un axe d'illumination, d'un échantillon, et d'un axe de détection. Les axes peuvent être séparés dans différents bras ou réunis sur une portion du montage optique et sont généralement composés d'éléments optiques rigides passifs tels que des objectifs, miroirs, filtres... Ces différentes parties parfois très volumineuses peuvent être remplacées ou déportées à l'aide de fibres optique. Nous allons voir par la suite plusieurs types de microscopes embarqués utilisant une fibre optique.
+Les propriétés de guidage de la lumière d'une fibre optique lui permettent d'alléger considérablement ou de déporter certaines parties des microscopes pour les rendre compatibles avec l'imagerie embarquée. Un microscope est en effet composé d'un axe d'illumination, d'un échantillon, et d'un axe de détection. Les axes peuvent être séparés dans différents bras ou réunis sur une portion du montage optique et sont généralement composés d'éléments optiques rigides passifs tels que des objectifs, miroirs, filtres... Ces différentes parties parfois très volumineuses peuvent être remplacées ou déportées à l'aide d'une fibre optique. Nous allons voir par la suite plusieurs types de microscopes embarqués utilisant une fibre optique.
\begin{figure}
\centering
@@ -207,7 +206,7 @@ \subsubsection{Déportation de l'illumination}
\subsubsection{Déportation de l'illumination et de la détection}
-Dans les exemples précédents, le laser est amené par une fibre, mais le capteur est sur place, le signal repartant sous forme de signal électrique. Il est également possible de déporter le système de détection en collectant la lumière par fibre optique. Certains utilisent pour cela une fibre multimode \cite{piyawattanametha_vivo_2009} \cite{sawinski_visually_2009}, d'autres une "fibre plastique" \cite{klioutchnikov_three-photon_2020}, d'autres encore un faisceau de fibres \cite{zong_fast_2017}. Dans ce cas, la lumière collectée est mesurée en sortie de fibre à l'aide d'un système optique adapté sans limite d'encombrement. On peut ainsi utiliser des sytèmes régulés en température ou munis d'une électronique complexe.
+Dans les exemples précédents, le laser est amené par une fibre, mais le capteur est sur place, le signal repartant sous forme de signal électrique. Il est également possible de déporter le système de détection en collectant la lumière par fibre optique. Certains utilisent pour cela une fibre multimode \cite{piyawattanametha_vivo_2009} \cite{sawinski_visually_2009}, d'autres une \emph{fibre plastique} \cite{klioutchnikov_three-photon_2020}, d'autres encore un faisceau de fibres \cite{zong_fast_2017}. Dans ce cas, la lumière collectée est mesurée en sortie de fibre à l'aide d'un système optique adapté sans limite d'encombrement. On peut ainsi utiliser des sytèmes régulés en température ou munis d'une électronique complexe.
\subsubsection{Lentilles à gradient d'indice}
@@ -224,7 +223,7 @@ \subsubsection{Microendoscopes}
\section{Caractérisation et utilisation de fibres à âme vide}
-Nous avons vu dans la partie précédente qu'une fibre optique permet de guider la lumière, que ce soit pour éclairer l'échantillon ou collecter le signal. Les fibres de verre conviennent bien aux applications classiques, mais posent des problèmes d'interaction lumière-matière lors de la transmission d'impulsions à haute énergie pour la microscopie multiphoton et nécessitent une précompensation de la dispersion. Les fibres à âme vide permettent de contourner ces problèmes et ont déjà été largement utilisées dans des microscopes embarqués sur rongeur \cite{tai_two-photon_2004} \cite{flusberg_vivo_2005} \cite{engelbrecht_ultra-compact_2008} \cite{piyawattanametha_vivo_2009} \cite{choi_improving_2014} \cite{klioutchnikov_three-photon_2020}. C'est donc vers celles-ci que nous nous sommes tournés. Nous avons testé plusieurs modèles fournis par l'entreprise \href{http://www.glophotonics.fr/}{Glophotonics}.
+Nous avons vu dans la partie précédente qu'une fibre optique permet de guider la lumière, que ce soit pour éclairer l'échantillon ou collecter le signal. Les fibres de verre conviennent bien aux applications classiques, mais posent des problèmes d'interaction lumière-matière lors de la transmission d'impulsions à haute énergie pour la microscopie multiphoton et nécessitent une précompensation de la dispersion. Les fibres à âme vide permettent de contourner ces problèmes et ont déjà été largement utilisées dans des microscopes embarqués sur rongeur \cite{tai_two-photon_2004} \cite{flusberg_vivo_2005} \cite{engelbrecht_ultra-compact_2008} \cite{piyawattanametha_vivo_2009} \cite{choi_improving_2014} \cite{klioutchnikov_three-photon_2020}. C'est donc vers celles-ci que nous nous sommes tournés. Nous avons testé plusieurs modèles fournis par l'entreprise \href{http://www.glophotonics.fr/}{Glophotonics} (Fig. \ref{FIGfibercomparison}).
% TODO VolkerComment2
% What are our requirements ? Detail this ...
@@ -237,14 +236,14 @@ \subsection{Comparaison de fibres}
% TODO VolkerComment2
% No, we did not record with these fibers. The mode field diameter was to large and the instabilities to bending were to large. Or do you have successful recordings with these fibers? The Brighton experiments were done with the fiber PMC-C-1C-R&D2
-Au début, nous avons utilisé des fibres ayant une bande de transmission uniquement dans l'infrarouge. Ces fibres ont permis de réaliser les premiers enregistrements deux photons de l'activité neuronale mais sont sensibles aux déformations, ce qui empêche l'enregistrement lors de la rotation du microscope. Ensuite, nous avons cherché à permettre à la fois la transmission d'un laser 1P et 2P, d'où l'utilisation de fibres avec plusieurs bandes de transmission. Parmi ces fibres, nous avons retenu le modèle PMC-C-9005 B2 qui permet une bonne transmission (97\% à 930 nm sur 1,5 m de fibre contre 70\% pour PMC-C-1C-R\&D2). J'utilise ce modèle comme référence par la suite.
+Au début, nous avons utilisé des fibres ayant une bande de transmission uniquement dans l'infrarouge. Ces fibres ont permis de réaliser les premiers enregistrements deux photons de l'activité neuronale mais sont sensibles aux déformations, ce qui empêche l'enregistrement lors de la rotation du microscope. Ensuite, nous avons cherché à permettre à la fois la transmission d'un laser 1P et 2P, d'où l'utilisation de fibres avec plusieurs bandes de transmission. Parmi ces fibres, nous avons retenu le modèle PMC-C-9005 B2 qui permet une bonne transmission (97\% à 930 nm sur 1,5 m de fibre contre 70\% pour PMC-C-1C-R\&D2) (Fig. \ref{FIGfibercomparison}). J'utilise ce modèle comme référence par la suite.
\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=\textwidth]{./files/glofibers.svg.png}
-\caption{Comparaison de plusieurs fibres fournies par Glophotonics. Les schémas représentent la largeur du cœur (en noir) et la largeur du mode propre (en rouge). Dans le spectre de transmission, on s'intéresse à la valeur à 930 nm et à 488 nm si possible. La valeur de la dispersion est toujours la même, environ à 1 ps/nm.km. Les trois premières fibres ont un motif de Kagomé, alors que la dernière n'est composée que d'une couche de capillaires. Seule la troisième fibre a un cœur hexagonal, les autres ont un cœur hypocycloïde. La valeur du paramètre de courbure est notée b, comme défini dans Debord \emph{et al} \cite{debord_hypocycloid-shaped_2013}.
-\label{FIGfibercomparison}}
-\end{figure}
+ \centering
+ \includegraphics[width=\textwidth]{./files/glofibers.svg.png}
+ \caption{Comparaison de plusieurs fibres fournies par Glophotonics. Les schémas représentent la largeur du cœur (en noir) et la largeur du mode propre (en rouge). Dans le spectre de transmission, on s'intéresse à la valeur à 930 nm et à 488 nm si possible. La valeur de la dispersion est toujours la même, environ à 1 ps/nm.km. Les trois premières fibres ont un motif de Kagomé, alors que la dernière n'est composée que d'une couche de capillaires. Seule la troisième fibre a un cœur hexagonal, les autres ont un cœur hypocycloïde. La valeur du paramètre de courbure est notée b, comme défini dans Debord \emph{et al} \cite{debord_hypocycloid-shaped_2013}.
+ \label{FIGfibercomparison}}
+ \end{figure}
% La figure \ref{FIGfibercomparison} compare plusieurs modèles de fibre. Les deux premières ont une large bande de transmission dans l'infrarouge et un mode propre large. Les autres ont deux bandes de transmission qui convrent à la fois le bleu et l'infrarouge
@@ -262,17 +261,9 @@ \subsubsection{Principe}
f = D\frac{\pi w}{4\lambda}
$$
-\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=0.7\textwidth]{./files/injection.svg.png}
-\caption{schéma de l'injection à deux lasers dans la fibre. Le miroir M2 est amovible et permet de basculer entre l'injection 1P et 2P. (BEX = \emph{Beam Expander}, IL = \emph{Injection Lens}, NCF = \emph{Negative Curvature Fiber})
-\\ Pour la première étape, on injecte un laser visible par l'autre extrémité de la fibre et l'on joue sur les miroirs M1 et M2 pour pointer vers la sortie du laser 2P.
-\label{FIGinjection}}
-\end{figure}
-
\subsubsection{Injection 2P}
-Le laser "Mai-Tai" que j'ai utilisé délivre un faisceau quasiment gaussien (M²<1.1) et son waist ($w_0$) est large d'environ 1 mm. Ces valeurs sont données par la documentation pour une utilisation à 800 nm, mais elles peuvent évoluer légèrement en accordant la longueur d'onde de fonctionnement. La largeur d'un faisceau gaussien au long de sa propagation ($z$) est définie par :
+Le laser \emph{Mai-Tai} que j'ai utilisé délivre un faisceau quasiment gaussien (M²<1.1) et son waist ($w_0$) est large d'environ 1 mm. Ces valeurs sont données par la documentation pour une utilisation à 800 nm, mais elles peuvent évoluer légèrement en accordant la longueur d'onde de fonctionnement. La largeur d'un faisceau gaussien au long de sa propagation ($z$) est définie par :
$$
w(z) = w_0 \, \sqrt{ 1+ {\left( \frac{z}{z_\mathrm{R}} \right)}^2 } \qquad \text{avec} \qquad
@@ -289,7 +280,15 @@ \subsubsection{Injection 2P}
\subsubsection{Injection combinée 2P + 1P}
-Pour injecter un deuxième laser, il faut à nouveau faire coïncider le mode de la fibre avec celui du laser, mais en conservant la même lentille d'injection et sans utiliser la platine de translation. Il faut donc adapter la largeur du faisceau à l'aide d'un télescope ou \emph{beam expander} (BEX). En remplaçant 915 nm par 488 nm, on obtient D = 1 mm. La lentille étant optimisée pour l'infrarouge, sa transmission dans le bleu n'est que de 50\%, mais la puissance du laser bleu est suffisante pour compenser cette perte. Par contre, la fibre n'est pas tout à fait monomode à cette longueur d'onde, et l'on distingue clairement en sortie le mode TEM11 ou les modes TEM10 / TEM01 en fonction de la position de la fibre. La meilleure transmission obtenue est de l'ordre de 50\%, mais cela est suffisant pour l'imagerie statique (fibre immobile).
+\begin{figure}[b!]
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.7\textwidth]{./files/injection.svg.png}
+ \caption{Injection à deux lasers dans la fibre. Le miroir M2 est amovible et permet de basculer entre l'injection 1P et 2P. (BEX = \emph{Beam Expander}, IL = \emph{Injection Lens}, NCF = \emph{Negative Curvature Fiber})
+ \\ Pour la première étape, on injecte un laser visible par l'autre extrémité de la fibre et l'on joue sur les miroirs M1 et M2 pour pointer vers la sortie du laser 2P. Une fois les miroirs préalignés, on démarre le laser 2P et on optimise la puissance en sortie de la fibre avec les miroirs M1 et M2 et la platine xyz. Ensuite, on escamote le miroir M2 pour aligner le laser 1P avec les miroirs M3 et M4 sant toucher à la platine xyz.
+ \label{FIGinjection}}
+ \end{figure}
+
+Pour injecter un deuxième laser, il faut à nouveau faire coïncider le mode de la fibre avec celui du laser, mais en conservant la même lentille d'injection et sans utiliser la platine de translation (Fig. \ref{FIGinjection}). Il faut donc adapter la largeur du faisceau à l'aide d'un télescope ou \emph{beam expander} (BEX). En remplaçant 915 nm par 488 nm, on obtient D = 1 mm. La lentille étant optimisée pour l'infrarouge, sa transmission dans le bleu n'est que de 50\%, mais la puissance du laser bleu est suffisante pour compenser cette perte. Par contre, la fibre n'est pas tout à fait monomode à cette longueur d'onde, et l'on distingue clairement en sortie le mode TEM11 ou les modes TEM10 / TEM01 en fonction de la position de la fibre. La meilleure transmission obtenue est de l'ordre de 50\%, mais cela est suffisant pour l'imagerie statique (fibre immobile).
\subsection{Propriétés}
@@ -298,13 +297,13 @@ \subsection{Propriétés}
\subsubsection{Dispersion et pré-compensation}
-Un paramètre important pour la transmission d'un laser pulsé est la dispersion. C'est celui qui nous force à utiliser des fibres à cœur creux et qui permet de conserver une impulsion aussi courte que possible. Mais la dispersion d'une fibre à cœur creux n'est pas nulle, elle est de l'ordre de 1 ps/nm/km (élargissement temporel / largeur spectrale / distance parcourue) comme on peut le voir sur la courbe. La largeur spectrale d'une impulsion est donnée par
+Un paramètre important pour la transmission d'un laser pulsé est la dispersion. C'est celui qui nous force à utiliser des fibres à cœur creux et qui permet de conserver une impulsion aussi courte que possible. Mais la dispersion d'une fibre à cœur creux n'est pas nulle, elle est de l'ordre de 1 ps/nm/km (élargissement temporel / largeur spectrale / distance parcourue) comme on peut le voir sur la courbe. La largeur spectrale d'une impulsion vaut 28 nm, elle est donnée par la formule :
$$
\Delta \lambda_t = \frac{\lambda^2}{c\Delta t}
$$
-et vaut donc 28 nm. Pour une impulsion de 100 fs à 915 nm, cela donne un élargissement de l'ordre de 28 fs au bout d'un mètre de propagation dans la fibre, soit une perte de concentration de 30\% et donc une perte d'effet deux photons de 50\%. Heureusement, il est possible de pré-compenser cette dispersion à l'aide d'un système optique placé en amont de la fibre. Le laser "Mai-Tai" est justement accompagné d'un élément "Deepsee" qui permet une telle précompensation réglable de -8 900 à -24 500 fs² d'après la documentation.
+Pour une impulsion de 100 fs à 915 nm, cela donne un élargissement de l'ordre de 28 fs au bout d'un mètre de propagation dans la fibre, soit une perte de concentration de 30\% et donc une perte d'effet deux photons de 50\%. Heureusement, il est possible de pré-compenser cette dispersion à l'aide d'un système optique placé en amont de la fibre. Le laser \emph{Mai-Tai} est justement accompagné d'un élément \emph{Deepsee} qui permet une telle précompensation réglable de -8 900 à -24 500 fs² d'après la documentation.
% (citation documentation)
% > The amount of dispersion, or GVD compensation, provided for each wavelength depends on the position of the DeepSee motor that moves optical material on a stage within the beam path.
@@ -320,7 +319,7 @@ \subsubsection{Gain de courbure}
Les propriétés de transmission de la fibre peuvent varier avec la courbure de celle-ci. La transmission est généralement optimale pour une fibre droite et se détériore suivant le rayon de courbure avec des pertes mesurées en dB. Une fibre PCNC-FC-K13-001 que je ne présente pas ici donnait des variations de transmission de l'ordre de 20\% pour un rayon de courbure de 5 cm.
Lors d'une expérience, la rotation du microscope engendre des déformations de la fibre, et donc des variations de transmission. L'éclairage incident se retrouve corrélé à la stimulation, ce qui crée un signal parasite. Un signal parasite supérieur à 1\% détériore trop le rapport signal à bruit et empêche l'analyse des données. On cherche donc à caractériser les pertes de transmission liées à la courbure. Pour cela, il suffit de placer un puissance-mètre en sortie de fibre et de faire varier la courbure.
-Des modèles numériques \cite{setti_flexible_2013} \cite{yu_negative_2016} \cite{frosz_analytical_2017} suggèrent que le gain évolue de manière inversement proportionelle au carré du rayon de courbure. Cette relation est également observée sur notre fibre.
+Des modèles numériques \cite{yu_negative_2016} \cite{setti_flexible_2013} \cite{frosz_analytical_2017} suggèrent que le gain évolue de manière inversement proportionelle au carré du rayon de courbure. Cette relation est également observée sur notre fibre.
Les pertes par mètre de fibre courbée restent cependant petites même pour un rayon assez court. Elles valent 0.1 dB ($\sim$2\%) pour un rayon de courbure de 7 cm.
En conditions réelles, on peut s'arranger pour limiter la courbure et répartir les déformations sur l'ensemble de la fibre. Par exemple, la fibre peut être placée le long d'une tige de rigidité plus élevée. Lors du déplacement d'une extrémité, une portion droite de 1 m de fibre se trouve courbée avec un rayon de 20 cm, ce qui donne des pertes de 0.01 dB, soit 0.2\%.
@@ -328,17 +327,17 @@ \subsubsection{Gain de courbure}
% OK Volker (fiber curvature real conditions)
% pourqui c'est le pire des cas ? Dans quelle context? I do not understand your argument. What is the range of curvature change in your experimental configuration?
-\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=0.8\textwidth]{./files/fiber_bending.svg.png}
-\caption{Propriétés de la fibre lors d'une courbure.
-\\ a. schéma du setup de catactérisation
-\\ b. gain en fonction de la courbure
-\\ c. ellipticité en fonction de la courbure (quasi circulaire)
-\\ d. angle de polarisation en fonction de la courbure (quasi linéaire)
-\\ e. profil d'intensité en sortie de fibre pour différentes courbures (non affecté).
-\label{FIGfibercarac}}
-\end{figure}
+\begin{figure}[t!]
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.7\textwidth]{./files/fiber_bending.svg.png}
+ \caption{Propriétés de la fibre lors d'une courbure.
+ \\ a. schéma du setup de catactérisation
+ \\ b. gain en fonction de la courbure
+ \\ c. ellipticité en fonction de la courbure (quasi circulaire)
+ \\ d. angle de polarisation en fonction de la courbure (quasi linéaire)
+ \\ e. profil d'intensité en sortie de fibre pour différentes courbures (non affecté).
+ \label{FIGfibercarac}}
+ \end{figure}
% TODO VolkerComment2
% You have to write the figure legend ! You have to describe every panel and give the meaning of the appreciations.
@@ -347,11 +346,19 @@ \subsubsection{Gain de courbure}
% (via rocketchat) Add also the measurement of the fiber output profile as a function of bending diameter to your thesis. Your measurement shows that at 915nm the profile does and thus the mode does not change.
\subsubsection{Polarisation}
-
% OK Volker (context for polarization -> de Vito)
% You start this paragraph totally out of context. So far you talked about the fiber properties. Here you talk about detected signal in the light sheet configuration. You have to introduce this properly and develop the transition.
-On voit dans la section précédente que la courbure a un effet sur la transmission négligeable dans le contexte de l'imagerie. Cependant, un autre aspect peut influencer la quantité de lumière détectée : la polarisation. La sensibilité à la polarisation dépend de la configuration d'éclairage (parallèle ou orthogonale), du type d'absorption (un ou deux photons), et du comportement de la fibre en réponse à une courbure.
+On voit dans la section précédente que la courbure a un effet sur la transmission négligeable dans le contexte de l'imagerie. Cependant, un autre aspect peut influencer la quantité de lumière détectée : la polarisation. La sensibilité à la polarisation dépend de la configuration d'éclairage (parallèle ou orthogonale, Fig. \ref{FIGpolarisation}), du type d'absorption (un ou deux photons), et du comportement de la fibre en réponse à une courbure.
+
+\begin{figure}[hb!]
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.5\textwidth]{./files/polarization_plane.svg.png}
+ \caption{Comparaison d'un microscope classique et d'un microscope à feuille de lumière du point de vue de la polarisation.
+ \\ a. Dans un microscope classique, la direction d'émission et de détection sont parallèles, et la polarisation est dans le plan orthogonal. La lumière détectée ne dépend donc pas de la direction de polarisation.
+ \\ b. Dans un microscope à feuille de lumière, la direction d'émission est dans le plan orthogonal à la détection. La direction de polarisation fait alors un angle $\alpha$ avec la direction de détection. Pour $\alpha$ = 90°, la lumière détectée est maximale, mais pour $\alpha$ = 0°, elle est minimale.
+ \label{FIGpolarisation}}
+ \end{figure}
\paragraph{Direction d'illumination}
@@ -364,14 +371,6 @@ \subsubsection{Polarisation}
% \int_0^\frac{\pi}{2} \sin(\theta)\cos(\theta) \mathrm{d}\theta = \left[ \frac{1}{2}\sin^2(\theta) \right]_0^\frac{\pi}{2} = \frac{1}{2}
% $$
-\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=0.5\textwidth]{./files/polarization_plane.svg.png}
-\caption{Comparaison d'un microscope classique et d'un microscope à feuille de lumière du point de vue de la polarisation.
-\\ a. Dans un microscope classique, la direction d'émission et de détection sont parallèles, et la polarisation est dans le plan orthogonal. La lumière détectée ne dépend donc pas de la direction de polarisation.
-\\ b. Dans un microscope à feuille de lumière, la direction d'émission est dans le plan orthogonal à la détection. La direction de polarisation fait alors un angle $\alpha$ avec la direction de détection. Pour $\alpha$ = 90°, la lumière détectée est maximale, mais pour $\alpha$ = 0°, elle est minimale.
-\label{FIGpolarisation}}
-\end{figure}
% OK VolkerComment2
% Work over the figure legend. Each panel needs a to be introduced in the legend with a subtitle. The blue arrow indicates the excitation and not the emission.
@@ -397,22 +396,22 @@ \subsubsection{Polarisation}
En polarisation circulaire ($\theta$ = 45°), la rotation n'est plus un problème, mais la fibre peut toujours transformer la polarisation circulaire en une polarisation elliptique, qui perd sa symétrie et devient donc sensible à la rotation. J'ai caractérisé la variation d'ellipticité dans le cas d'une polarisation circulaire. Les plus grandes variations d'ellipticité enregistrées sont de l'ordre de 5°. Pour vérifier comment ces différents éléments entrent en jeu, j'ai réalisé des tests en conditions réelles.
-\subsubsection{Test en conditions réelles}
+\begin{figure}[hb!]
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.6\textwidth]{./files/real-condition_intensity-variation.png}
+ \caption{Test de la fibre en conditions expérimentales. La variation de l'intensité détectée est une combinaison des pertes de courbure, du changement d'ellipticité et de la rotation de la polarisation.
+ \\ a. Montage expérimental pour test en conditions réelles. Un puissance-mètre peut être installé en position P1 (intensité seulement) ou P2 (intensité après cube séparateur de polarisation).
+ \\ b. Réponse à une stimulation sinusoïdale périodique de 10°. On constate que les variations de puissance ne dépassent pas 0.6\% et que ces variations combinées aux changements de la polarisation (ellipticité et rotation) n'excèdent pas 1.2\%.
+ \\ c. Réponse à une stimulation périodique en marches de 20°. Les variations combinées n'excèdent pas 1.2\%. On remarque que l'intensité maximale est atteinte pour un angle du moteur de 0°, soit la position de repos de la fibre.
+ \label{FIGrealconditionsfiber}}
+\end{figure}
% TODO VolkerComment2
% You have to introduce the NA expander and show a schematic of the experiment
-Pour tester les variations d'intensité dues aux déformations de la fibre en conditions réelles, j'ai monté un cube polariseur et un puissance-mètre à la place de l'échantillon et ai soumis l'ensemble à des stimulations périodiques guidées par un moteur (Fig. \ref{FIGrealconditionsfiber}).
+\subsubsection{Test en conditions réelles}
-\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=0.7\textwidth]{./files/real-condition_intensity-variation.png}
-\caption{Test de la fibre en conditions expérimentales. La variation de l'intensité détectée est une combinaison des pertes de courbure, du changement d'ellipticité et de la rotation de la polarisation.
-\\ a. Montage expérimental pour test en conditions réelles. Un puissance-mètre peut être installé en position P1 (intensité seulement) ou P2 (intensité après cube séparateur de polarisation).
-\\ b. Réponse à une stimulation sinusoïdale périodique de 10°. On constate que les variations de puissance ne dépassent pas 0.6\% et que ces variations combinées aux changements de la polarisation (ellipticité et rotation) n'excèdent pas 1.2\%.
-\\ c. Réponse à une stimulation périodique en marches de 20°. Les variations combinées n'excèdent pas 1.2\%. On remarque que l'intensité maximale est atteinte pour un angle du moteur de 0°, soit la position de repos de la fibre.
-\label{FIGrealconditionsfiber}}
-\end{figure}
+Pour tester les variations d'intensité dues aux déformations de la fibre en conditions réelles, j'ai monté un cube polariseur et un puissance-mètre à la place de l'échantillon et ai soumis l'ensemble à des stimulations périodiques guidées par un moteur (Fig. \ref{FIGrealconditionsfiber}).
Finalement, tous les effets liés à la position de la fibre engendrent des variations de l'intensité détectée inférieures à 1.2\% dans les conditions des expériences. Les effets parasites sont donc connus et mineurs, ce qui est à prendre en compte lors de l'analyse des données.
@@ -441,11 +440,11 @@ \section{Effet de lentille thermique}
% (conséquences gênantes) Incomprehensible ... . Explain this more in detail.
\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=0.7\textwidth]{./files/water_instability.svg.png}
-\caption{Images extraites d'un film montrant les changements d'intensité liés à l'effet thermique. On y voit la distribution d'intensité lumineuse se déplacer de gauche à droite (direction de propagation du faisceau) au rythme des mouvements du moteur. La plateforme est tournée suivant un mouvement sinusoïdal d'amplitude 10° à 0.08 Hz (en rouge). Le rectangle indique une zone dont le signal calcique est moyenné pour chaque pas de temps (100 ms d'exposition) et affiché en bleu. Les variations, de l'ordre de 20\%, ne sont pas dues à l'activité des neurones, mais à un changement d'illumination.
-\label{FIGwaterinstability}}
-\end{figure}
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.7\textwidth]{./files/water_instability.svg.png}
+ \caption{Images extraites d'un film montrant les changements d'intensité liés à l'effet thermique. On y voit la distribution d'intensité lumineuse se déplacer de gauche à droite (direction de propagation du faisceau) au rythme des mouvements du moteur. La plateforme est tournée suivant un mouvement sinusoïdal d'amplitude 10° à 0.08 Hz (en rouge). Le rectangle indique une zone dont le signal calcique est moyenné pour chaque pas de temps (100 ms d'exposition) et affiché en bleu. Les variations, de l'ordre de 20\%, ne sont pas dues à l'activité des neurones, mais à un changement d'illumination.
+ \label{FIGwaterinstability}}
+ \end{figure}
% OK VolkerComment2
% Add a scale bar. Indicate the microscope rotation angle corresponding to each image. Indicate the time points and show the stimulation. I guess it is a sinus .. . Draw two ROIs mirror symmetric to the midplane and show the average intensity over time.
@@ -462,11 +461,11 @@ \subsection{Effet statique}
Le phénomène de lentille thermique a été décrit théoriquement en 1965 par Gordon \emph{et al} \cite{gordon_longtransient_1965} et en 1974 par Whinnery \emph{et al} \cite{whinnery_laser_1974} pour une fine cellule de liquide et dans le cadre de l'approximation parabolique (partie \ref{cellulefine}). En 1982, Sheldon \emph{et al} \cite{sheldon_laser-induced_1982} étend cette description hors de l'approximation parabolique pour prendre en compte les aberrations induites. Dans notre cas, il ne s'agit pas d'une cellule fine, car le laser traverse plusieurs centimètres d'eau avant d'atteindre l'échantillon, créant un gradient d'indice sur sa trajectoire. Je me suis donc inspiré du livre \emph{Gradient-Index Optics} \cite{gomez-reino_gradient-index_2002}, dans lequel les auteurs s'intéressent à la propagation d'un faisceau dans un milieu à gradient d'indice : (équation 1.63 du livre)
\begin{figure}
-\centering
-\includegraphics[width=0.6\textwidth]{./files/gordon_lens.png}
-\caption{Lentille équivalente pour une cellule de largeur $l$ d'indice parabolique dans laquelle un rayon lumineux se propage en arc de cercle. Extrait de Gordon \emph{et al} \cite{gordon_longtransient_1965}.
-\label{FIGgordonlens}}
-\end{figure}
+ \centering
+ \includegraphics[width=0.6\textwidth]{./files/gordon_lens.png}
+ \caption{Lentille équivalente pour une cellule de largeur $l$ d'indice parabolique dans laquelle un rayon lumineux se propage en arc de cercle. Extrait de Gordon \emph{et al} \cite{gordon_longtransient_1965}.
+ \label{FIGgordonlens}}
+ \end{figure}
$$
n(r,z) = n_0(z) \left( 1 \pm \frac{g^2(z)}{2}r^2\right)
@@ -598,7 +597,7 @@ \subsubsection{Rapport signal à bruit}
\paragraph{Alignement sur le cerveau de référence}
Un cerveau imagé en deux photons apparaît assez différent d'un cerveau en un photon. J'ai donc réalisé un cerveau de référence en deux photons dans l'espace de référence du laboratoire. Malgré cela, pour un rapport signal à bruit trop faible, l'alignement automatique sur le cerveau de référence est impossible. J'ai donc dû faire la plupart des alignements à la main en utilisant le logiciel 3DSlicer.
\paragraph{Moyennage des cartes de phase}
-Pour réaliser une carte de phase moyenne, on moyenne séparément la partie réelle et la partie imaginaire du nombre imaginaire obtenu au pic de la transformée de Fourier. Cependant, pour un niveau de signal faible, le rapport signal à bruit peut largement varier d'une expérience à l'autre. On doit donc appliquer une égalisation de contraste dépendant du module du nombre complexe.
+Calculer une carte de phase moyenne nécessite de moyenner séparément la partie réelle et la partie imaginaire du nombre complexe obtenu au pic de la transformée de Fourier. Cependant, pour un niveau de signal faible, le rapport signal à bruit peut largement varier d'une expérience à l'autre. On doit donc appliquer une égalisation de contraste dépendant du module du nombre complexe.
% TODO écrire le programme pour faire une égalisation de contraste permettant de moyenner
\subsubsection{Enregistrements en plusieurs étapes}
diff --git a/split/files/1P-2P.svg.png b/split/files/1P-2P.svg.png
index 74ef627..25186b1 100644
Binary files a/split/files/1P-2P.svg.png and b/split/files/1P-2P.svg.png differ
diff --git a/split/files/RAST.svg b/split/files/RAST.svg
index 4058f8a..ada1d35 100644
--- a/split/files/RAST.svg
+++ b/split/files/RAST.svg
@@ -10,9 +10,9 @@
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+
+
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+
+
+
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-
-
-
-
-
-
-
-
-
+ Right
- Right
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- ImageJ
+ Matlab
-
-
-
-
-
-
- RAS
- a.
- b.
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-
-
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+ id="path1006-5-2-3"
+ d="M 137.37097,217.35026 125.61898,203.0307"
+ style="fill:#0000ff;fill-opacity:1;stroke:#0000ff;stroke-width:1.80000019;stroke-linecap:butt;stroke-linejoin:miter;stroke-miterlimit:4;stroke-dasharray:none;stroke-opacity:1;marker-end:url(#Arrow1Mend-5-0-0)" />
+ RAS
+ a.
+ b.
+ c.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
diff --git a/split/files/RAST.svg.png b/split/files/RAST.svg.png
index d53745a..13a39cb 100644
Binary files a/split/files/RAST.svg.png and b/split/files/RAST.svg.png differ
diff --git a/split/files/analysis_illustration.svg b/split/files/analysis_illustration.svg
index eafbdde..96926cf 100644
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@@ -817,10 +817,10 @@
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index d3926c6..5225727 100644
Binary files a/split/files/analysis_illustration.svg.png and b/split/files/analysis_illustration.svg.png differ
diff --git a/split/files/appareil_vestibulaire.svg b/split/files/appareil_vestibulaire.svg
index 436021f..27b61d1 100644
--- a/split/files/appareil_vestibulaire.svg
+++ b/split/files/appareil_vestibulaire.svg
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